蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經(jīng)元細胞中的保護作用論文
研究發(fā)現，缺血再灌注損傷是對組織造成損傷的主要因素，即再次恢復血液供應，缺血組織灌注時(shí)造成的微血管和實(shí)質(zhì)器官的損傷，本研究旨在探討糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶1( SGK1) 在大腦缺血再灌注過(guò)程中可能的保護機制。
1 資料和方法
1. 1 樣本來(lái)源本研究用細胞為培養后的1 日齡SD 大鼠神經(jīng)元細胞。對SD 大鼠采用椎脫臼處死法處死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min; 取出海馬神經(jīng)元細胞進(jìn)行培養。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的額分離及培養選用1 日齡SD大鼠2 只。通過(guò)對大鼠進(jìn)行消毒后處死，獲取了SD 大鼠的海馬細胞，并進(jìn)行了體外培養。
1. 2. 2 已分離培養的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的'免疫熒光鑒定采用海馬神經(jīng)元特異性抗微管相關(guān)蛋白2(MAP2) 抗體免疫熒光來(lái)顯示分離和培養的結果，在顯微鏡下計數，記錄每個(gè)視野中染色陽(yáng)性的細胞占所有細胞的比值，超過(guò)95%的為陽(yáng)性。
1. 2. 3 通過(guò)氧糖剝奪誘導海馬神經(jīng)元凋亡將海馬神經(jīng)元細胞根據氧糖剝奪誘導時(shí)間不同分為正常海馬神經(jīng)元細胞組，氧糖剝奪誘導120 min 組、氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�10 min組、氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�30 min 組和氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�60 min 組。采用Annexin VFITC/PI 流式細胞術(shù)對樣品進(jìn)行檢測，區分實(shí)驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞。
1. 2. 4 Western 印跡技術(shù)檢測上述步驟中各種細胞的SGK1 表達實(shí)驗對樣本進(jìn)行總蛋白提取與定量，根據SGK1 的mRNA序列( 序列號: NM_001193568. 1) 設計了該基因的全基因引物，獲得目的基因SGK1 模板，構建質(zhì)粒載體，并進(jìn)行過(guò)表達效率檢測。
1. 3 統計學(xué)方法采用SPSS16. 0 進(jìn)行分析。
2 結果
2. 1 氧糖剝奪誘導海馬神經(jīng)元凋亡及SGK1 表達情況NC 代表未經(jīng)任何處理的培養過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞、OGD 表示對培養過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞進(jìn)行了120 min 的氧糖剝奪，而10 min 組、30 min 組和60 min 組則表示培養過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞在進(jìn)行了120 min 的氧糖剝奪之后分別進(jìn)行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供給。
2. 2 SGK1 基因蛋白水平的過(guò)表達能阻止氧糖剝奪120 min 的培養過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的凋亡與NC 組比較，轉染SGK1 過(guò)表達載體的細胞內，可以SGK1 導致mRNA 的表達增加約5 倍; 在轉染了SGK1 過(guò)表達病毒載體的細胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表達約超過(guò)未處理組的2. 5倍。海馬神經(jīng)元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體; 在轉染24 h 后，
SGK1 在基因水平和蛋白質(zhì)水平的變化情況和NC 相比具有顯著(zhù)性差異。海馬神經(jīng)元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體24 h，然后進(jìn)行120 min 的氧糖剝奪，然后使之恢復60 min; 運用流式細胞儀分析用膜聯(lián)蛋白V/PI 雙染色法來(lái)檢測細胞凋亡情況。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗檢測SGK1 和活化的金屬基質(zhì)蛋白酶(caspase) -3 蛋白水平差異情況。
3 討論
缺血性腦血管病是目前導致人類(lèi)，尤其是老年人致死和致殘率最高的疾病之一。對于缺血性腦血管病當前最主要的治療原則是對缺血區域進(jìn)行血液灌注; 然而近期發(fā)現對缺血性腦血管疾病的缺血再灌注非但沒(méi)有使組織功能恢復，反而會(huì )導致缺血所致的功能障礙和結構破壞進(jìn)一步加重，這種現象即缺血再灌注損傷，在各種模式生物和人類(lèi)研究中都得到了一致的結果。
本研究結果發(fā)現，對體外培養的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞進(jìn)行氧糖剝奪可導致SD 海馬神經(jīng)元細胞凋亡數量的增加，而之后隨著(zhù)再恢復氧糖供應時(shí)間的增加，神經(jīng)元細胞凋亡的數據則呈現進(jìn)一步加劇的趨勢。而SGK1 的過(guò)表達則可以抑制SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞因氧糖剝奪導致的細胞凋亡的趨勢。另外本結果顯示，SGK1 的過(guò)表達能顯著(zhù)降低因氧糖剝奪導致的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的數量，這一結果得到了熒光輔助細胞篩選分析的支持，提示Akt 和GSK-β 可對經(jīng)受缺血再灌注海馬神經(jīng)元細胞能起到保護作用。
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