詳談自噬在腦缺血性損傷中的作用論文

　　自噬(autophagy)是細胞受到刺激后，通過(guò)溶酶體途徑降解細胞內物質(zhì)的統稱(chēng)，是近年來(lái)逐漸被認識的細胞除壞死和凋亡外的第3種死亡方式。在通常情況下，自噬在多數細胞內都處于一個(gè)相當低的水平。當細胞受到外界因素刺激，如饑餓、缺氧、高溫或損傷、過(guò)多的細胞器和胞質(zhì)成分積聚等多種情況下，則會(huì )產(chǎn)生過(guò)度自噬。腦缺血是由于腦組織血流不足，腦細胞代謝障礙，最終導致腦細胞不可逆性損傷和死亡的一系列病理生理學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，眾多研究表明，自噬參與了腦缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程�，F就自噬在腦缺血性損傷中的作用綜述如下。

　　1 自噬的形成過(guò)程及分子機制根據細胞物質(zhì)到達溶酶體腔途徑的不同，自噬可以分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導的自噬3種形式。我們通常所說(shuō)的“自噬”主要指大自噬，其過(guò)程可以被人為地分成4步，包括自噬的誘導、自噬體膜的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內容物的降解。第1步，營(yíng)養物質(zhì)豐富(如復糖復氧)的情況下，雷帕霉素靶蛋白C1復合物(mTORC1)與哺乳動(dòng)物同源物ULK復合物ULK1/2mAtg13FIP200Atg101結合，促使ULK1(或ULK2)磷酸化及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶自噬相關(guān)基因13(autophagyrelatedgene13，Atg13)mAtg13的高度磷酸化，從而對自噬的誘導產(chǎn)生抑制作用。但是當環(huán)境營(yíng)養不足(如缺糖缺氧)的情況下，mTORC1與ULK復合物ULK1/2mAtg13FIP200Atg101分離，使mAtg13去磷酸化，自噬誘導開(kāi)始。第2步，磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol3kinase，PI3K)分為Ⅲ型，其中Ⅰ型PI3K抑制自噬的發(fā)生，而Ⅲ型PI3K促進(jìn)自噬的發(fā)生。PI3K復合物由Beclin1(Atg6的同源物)、Ⅲ型PI3K和p150(Vps15的同源物)組成，募集胞質(zhì)中含FYVE或PX基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成。第3步，Atgl2由El樣酶Atg7活化，之后轉運至E2樣酶Atgl0，最后與Atg5結合，形成自噬體前體[。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3，LC3)在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下脫去羥基端變成LC3Ⅰ，隨后LC3Ⅰ 被Atg7激活并轉位到Atg3，在A(yíng)tg3的作用下與PE連接并酯化形成LC3Ⅱ，定位于自噬體的內膜和外膜，形成完整的自噬體。因此，常把LC3Ⅱ/LC3Ⅰ作為自噬的標志蛋白。第4步，自噬體與溶酶體的融合需要溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomalassociatedmembraneprotein1，LAMP1)、LAMP2和lGTPaseRab7，但是具體的作用機制目前還不清楚。融合后，內容物開(kāi)始降解，其過(guò)程主要依賴(lài)一系列溶酶體水解酶，包括組織蛋白酶B、D、L，最后內容物降解產(chǎn)物通過(guò)溶酶體透性膜轉到胞液中被重新利用。

　　2 腦缺血后自噬的誘發(fā)因素腦缺血后自噬的誘發(fā)因素包括由大量活性氧、自由基的釋放引起的氧化應激，通過(guò)上調自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclinl表達從而誘導細胞自噬;內質(zhì)網(wǎng)應激即內質(zhì)網(wǎng)(ER)內穩態(tài)失衡后，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在ER積聚，通過(guò)對自噬相關(guān)信號通路哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)抑制后誘導細胞的自噬;海馬神經(jīng)細胞的JNK活性增強后通過(guò)引起神經(jīng)細胞興奮性毒性進(jìn)而誘導自噬和凋亡等。程序性死亡方式包括凋亡與自噬，二者作用交叉。其中Bcl2、Bclxl、Bax、caspase家族等基因稱(chēng)為凋亡相關(guān)基因，Bcl2蛋白水平下降能引起自噬激活，caspase對細胞自噬也具有十分重要的作用，它們可以裂解自噬相關(guān)蛋白，裂解后的蛋白碎片具有促進(jìn)細胞凋亡的作用。

　　3 參與腦缺血后自噬的主要信號轉導通路自噬的調節較為復雜，有多條信號通路參與，其中主要包括mTOR、AMPKmTORC1信號通路、核因子NFκB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)介導的信號通路等。

　　3.1 PI3K/AktmTOR信號通路

　　mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括mTOR復合物1(mTORcomplex1，mTORCl)即雷帕霉素敏感型和mTOR復合物2(mTORcomplex2，mTORC2)即雷帕霉素欠敏感型。mTORCl是自噬的主要調節靶點(diǎn)，其主要調節因素包括糖和高能量狀態(tài)、各種應激以及該通路的上游信號分子;雷帕霉素和氧糖剝奪等引起的缺血缺氧情況下可穩定RaptormTOR的連接，抑制mTORCl的激酶活性，從而促進(jìn)自噬。上游信號分子主要包括PI3K/Akt中相關(guān)通路，正常情況下Beclinl可使PI3K活化，從而使得Akt在細胞膜上聚積;此時(shí)，Akt出現磷酸化，促進(jìn)腫瘤抑制基因TSC2編碼的蛋白磷酸化，激活raptormTOR復合物和mTORCl的激酶活性，從而抑制自噬。腦缺血損傷后，缺血缺氧刺激激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ，PPARγ)，抑制Beclinl活性后，抑制PI3K和Akt的活性，從而抑制mTORCl的激酶活性，因此產(chǎn)生自噬。

　　3.2 AMPKmTORC1信號通路

　　一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPactivatedkinase，AMPK)是能量傳感器，主要由催化亞基α和調節亞基β、γ組成，真核細胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶即是AMPK。大腦中大量存在催化亞基α1、α2，在能量缺乏如缺血缺氧等情況下被迅速激活，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的癥狀。LKB1激酶和Ca2+/鈣調蛋白依賴(lài)性激酶激酶β(Ca2+/calmodulindependentprotein kinasekinaseβ，CaMKKβ)屬于A(yíng)MPK的上游激酶。有研究發(fā)現，上調AMP/ATP比值或者升高Ca2+的濃度時(shí)，CaMKKβ會(huì )出現磷酸化，從而產(chǎn)生磷酸化的AMPK(pAMPK)，進(jìn)而抑制TSC1/2和mTORC1的活性產(chǎn)生自噬，調節該過(guò)程的還包括mTORC1的底物S6K1。Wang等研究證實(shí)抑制自噬相關(guān)信號通路mTOR的活性產(chǎn)生自噬后，其下游眾多的靶蛋白及信號通路如mTORC14EBPs激活和TSC2mTORS6K1抑制，影響蛋白質(zhì)翻譯、核糖體合成等代謝過(guò)程，從而參與腦缺血/再灌注后神經(jīng)細胞的自噬性死亡或加重細胞的自噬性損傷。

　　3.3 NFκB信號通路

　　哺乳動(dòng)物核因子(NF)κB的家族成員包括p50/p105(NFκB1)、p52/p100(NFκB2)、cRel、RecB、p65(RecA)等。正常情況下，NFκB位于胞質(zhì)中并與其抑制蛋白(IκB)緊密結合。當細胞受到缺血缺氧等因素刺激時(shí)，激活后的NFκB從胞質(zhì)轉移到胞核中，進(jìn)而上調p62蛋白的表達，從而使得p53、IκBα和Bcl2表達減弱，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclinl的表達增強，從而產(chǎn)生自噬。Li等為了誘導局灶性腦缺血模型，采用NFκB基因敲除小鼠，并對其大腦中的動(dòng)脈遠端分支結扎，結果發(fā)現NFκB途徑可調控腦缺血誘導的自噬樣損傷。Cui等研究發(fā)現在大鼠海馬區經(jīng)過(guò)缺血/再灌注損傷后，信號轉導通路NFκBp53參與損傷處相關(guān)的自噬與凋亡。

　　3.4 MAPK介導的信號通路

　　細胞外信號調節激酶(extracellularsignalrelatedkinase，ERK)、氨基末端激酶(JunNH2terminalkinase，JNK)和p38構成了MAPK。mTORC1是其下游調節分子，有研究發(fā)現，在腦缺血/再灌注中的缺血缺氧刺激下，MAPKmTOR信號通路能夠降低LC3、Beclin1和抗胸腺細胞球蛋白等自噬相關(guān)蛋白的水平，使得ERK、Akt、磷酸肌醇依賴(lài)性激酶(PDK1)的活性受到抑制，進(jìn)而激活mTOR、JNK、p38、蛋白絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(PTEN)的活性，從而產(chǎn)生自噬。

　　3.5 其它

　　此外，調節和誘導自噬的途徑還包括信號轉導通路p53，Ras/蛋白激酶A(PKA)和毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白激酶(ATM)mTOR，以及Bcl2與Beclinl復合體等。

　　4 自噬在腦缺血性損傷中的作用研究證明，細胞損傷的嚴重程度直接關(guān)系到自噬在腦缺血性損傷中的作用。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過(guò)降解蛋白提供能量，而且能夠通過(guò)降解損傷的蛋白后合成新的蛋白，從而保護著(zhù)機體的細胞。若重度饑餓、缺氧，或延長(cháng)細胞損傷的時(shí)間，激活凋亡相關(guān)調控蛋白產(chǎn)生凋亡后，自噬也過(guò)度激活，過(guò)度激活的自噬又進(jìn)一步促進(jìn)凋亡的發(fā)生，從而對機體產(chǎn)生損傷作用[3]。

　　4.1 自噬減輕腦缺血損傷

　　有研究表明，自噬可保護神經(jīng)細胞，減輕缺血性損傷。Carloni等通過(guò)對新生1周SD大鼠腦部缺糖缺氧后發(fā)現，短時(shí)間內即可產(chǎn)生自噬，用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3methyladenine，3MA)和渥曼霉素(wortmannin，WM)抑制自噬后，壞死的細胞數量增多，而自噬激動(dòng)劑雷帕霉素使細胞壞死和凋亡明顯減少，且證明是通過(guò)PI3KAktmTOR通路對缺血后的損傷發(fā)揮保護作用。Chauhan等通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血模型和原代海馬神經(jīng)細胞缺糖缺氧損傷即氧糖剝奪(oxygenglucosedeprivation，OGD)模型，并采用MRI成像觀(guān)察，發(fā)現大鼠缺血后1h腹腔注射雷帕霉素可以使得腦梗死的體積減少，過(guò)氧化物歧化酶、谷氨酸等的釋放受到抑制，海馬神經(jīng)細胞OGD后產(chǎn)生自噬并一直能持續至復糖復氧后的48h，用自噬抑制劑3MA抑制自噬后，OGD模型的損傷加重，進(jìn)而從體內和體外水平證明自噬對該細胞造模后的損傷具有保護作用。Sheng等證實(shí)缺血預適應(ischemicpreconditioning，IPC)可誘導神經(jīng)細胞自噬，自噬抑制劑抑制自噬后可增加腦的梗死體積和水腫程度。而自噬激動(dòng)劑雷帕霉素作用后的效果則相反，其保護作用的發(fā)生過(guò)程主要通過(guò)IPC的直接保護神經(jīng)細胞以及上調熱休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)的表達，并已證實(shí)HSP70對細胞具有保護作用。Yan等對大鼠制備高壓氧預適應模型，發(fā)現自噬激動(dòng)劑雷帕霉素產(chǎn)生自噬后，能模擬高壓氧預適應的生物學(xué)效應，從而減輕腦缺血性損傷。Balduini等研究發(fā)現，缺血缺氧等應激狀態(tài)下的細胞存活較低，若自噬發(fā)生后，其存活率會(huì )明顯提高，因此認為自噬在應激狀態(tài)下對細胞產(chǎn)生保護作用。丁培炎等以短期禁食誘導大鼠腦局灶性缺血/再灌注模型，研究其損傷的作用，發(fā)現短期禁食后產(chǎn)生自噬，自噬能減輕該模型引起的損傷作用，因此證明該模型中自噬對細胞具有保護作用。Wang等研究腦缺血后自噬產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的主要機制，發(fā)現煙酰胺轉磷酸核糖激酶和ARRB1/βarrestin1是其分子機制的主要作用基礎，且該分子同時(shí)作用于BECN1與自噬。高博等通過(guò)制備局灶性腦缺血預適應模型，采用兩次插入線(xiàn)栓法引起內質(zhì)網(wǎng)應激并誘導出自噬，發(fā)現自噬在該模型中起保護作用，且用內質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑SAL能阻斷該保護作用，猜測SAL阻斷內質(zhì)網(wǎng)應激后，抑制了自噬的活性，從而阻斷了相關(guān)的保護作用。王燕梅等通過(guò)短暫全腦缺血和短暫全腦缺血-低氧處理建立短暫全腦缺血模型后，比較海馬CA1區中自噬相關(guān)蛋白LC3、LAMP2和組織蛋白酶D的蛋白表達情況，發(fā)現低氧后處理產(chǎn)生的自噬對短暫全腦缺血起保護作用。

　　4.2 自噬加重腦缺血損傷

　　另有研究證實(shí)，自噬可加重腦缺血損傷。Wen等通過(guò)對大鼠建立永久性腦缺血模型，發(fā)現缺血后即能產(chǎn)生大量的自噬，并且自噬抑制劑3MA和組織蛋白酶抑制自噬后，腦梗死體積減少，神經(jīng)自身修復功能增強，提示該損傷產(chǎn)生的自噬可加重腦缺血引起的損傷。Puyal等對新生12d的大鼠通過(guò)短暫性左側大腦中動(dòng)脈閉塞(transientmiddlecerebralarteryocclusion，tMCAO)造成局灶性腦缺血，發(fā)現損傷后可產(chǎn)生細胞的壞死、凋亡和自噬，在再灌注起始及3h后注射自噬抑制劑3MA，自噬抑制并且腦梗死體積明顯減少，因此認為自噬在局灶性腦缺血損傷中可加重腦缺血損傷。Wang等建立大鼠全腦缺血模型，并觀(guān)察海馬CAI區神經(jīng)細胞，發(fā)現自噬抑制劑3MA在缺血前1h或0.5h加入，全腦缺血引起的神經(jīng)元損傷能明顯減輕。Zheng等利用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)使得腦缺血大鼠體內自噬相關(guān)基因Beclinl表達下調，自噬抑制，皮質(zhì)和紋狀體處神經(jīng)細胞損傷減輕，能抑制神經(jīng)細胞的凋亡并可觀(guān)察到大量神經(jīng)細胞再生，提示自噬在該模型中可加重腦缺血損傷。Koike等利用ATG7缺陷的新生小鼠制作腦缺血模型，抑制了腦缺血中產(chǎn)生的自噬，結果發(fā)現ATG缺陷可保護腦缺血后海馬區神經(jīng)細胞引起的一系列損傷。石秋艷等對大鼠大腦中動(dòng)脈缺血1d、3d、5d后再灌注，觀(guān)察該時(shí)間對海馬自噬的影響，結果發(fā)現自噬水平下調后缺血/再灌注損傷減輕。Xu等發(fā)現抑制自噬后，可減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷，且PPARγ的激動(dòng)劑15脫氧前列腺素J2(15deoxyprostaglandinJ2，15dPGJ2)是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用主要分子基礎。Shi等對原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞和人神經(jīng)上皮瘤細胞(SHSY5Y)模擬體外腦缺血模型，發(fā)現自噬在缺糖缺氧6h后，復糖復氧24、48和72h后產(chǎn)生，并且該模型使得自噬過(guò)度激活，從而引起腦缺血后相關(guān)的神經(jīng)細胞死亡，加重腦缺血引起的損傷。Jiang等研究表明，自噬抑制劑3MA抑制自噬后，腦缺血產(chǎn)生的一系列炎癥可通過(guò)NFκB通路調節抑制，從而減輕了腦缺血后的損傷。Gao等研究表明腦缺血損傷后，抑制自噬相關(guān)的信號通路可減輕該損傷，并產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

　　5 結語(yǔ)

　　綜上，自噬既有利又有弊。自噬適度能使體內異常蛋白質(zhì)及受損或過(guò)多的細胞器得到清除，從而維持著(zhù)細胞的存活、分化、發(fā)育和穩態(tài);而過(guò)度的自噬，可引起自噬性細胞死亡，并和細胞死亡的另兩種形式凋亡、壞死交互作用，使細胞損傷加重。因此，研究腦缺血后自噬的相關(guān)作用，了解自噬的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，認清自噬發(fā)生的相關(guān)調節因素及信號通路，有助于根據自噬的特點(diǎn)和功能，針對腦缺血的治療方式，發(fā)現新的治療靶點(diǎn)和策略。

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