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pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的構建研究論文
應激蛋白Argonaute1是一種多功能蛋白，參與RNA干擾及應激顆粒(SGs)、加工體(PBs)形成等多種細胞生物學(xué)過(guò)程。pmCherry-C1是一種可以編碼紅色熒光蛋白的真核表達載體。2015年9～11月，本研究通過(guò)基因工程技術(shù)將Argonaute1基因片段連接至pmCherry-C1載體，構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒，旨在為深入研究Argonaute1蛋白的細胞生物學(xué)功能提供便利工具。
1材料與方法
1.1材料質(zhì)粒、菌株及細胞:pmCherry-C1載體由JohanPerane博士饋贈，感受態(tài)大腸桿菌Trans1購自天津科儀嘉欣科技有限公司，HeLa細胞來(lái)自本實(shí)驗室。酶類(lèi)及主要生化試劑:限制性?xún)惹忻窫coRⅠ、BamHⅠ及T4DNA連接酶均購自ThermoFisherScientific公司，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，T/A載體(pEASY-T1)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，質(zhì)�？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┧鱽�(lái)寶科技有限公司，去內毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司，LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購于KPL公司�？贵w:兔抗人Argonaute1單克隆抗體購自CST公司，鼠抗人G3BP單克隆抗體和兔抗人DCP1α抗體購自abcam公司，鼠抗人櫻桃紅蛋白(Cherry)單克隆抗體購自MBL公司，藍色熒光(AlexaFluor350)標記的驢抗鼠熒光二抗和綠色熒光(AlexaFluor488)標記的驢抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，辣根過(guò)氧化物酶標記的抗鼠和抗兔IgG二抗購自KPL公司。引物合成及基因測序由北京天一輝遠公司完成。
1.2pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒構建
1.2.1Argonaute1蛋白目的片段獲取提取HeLa細胞的總RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列進(jìn)行Argonaute1的cDNA擴增;根據CDS序列(NM012199.2)設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反轉錄的Argonaute1cDNA為模板，擴增PCR目的片段，條件為95℃預變性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)降低1℃，再以50℃進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min;將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將目的片段與pEASY-T1(T/A載體)于25℃連接15min。連接產(chǎn)物轉化Tran1-T1感受態(tài)細胞，置于含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。
1.2.2線(xiàn)性pmCherry-C1質(zhì)粒載體獲取以質(zhì)�？焖傩√嵩噭┖刑崛mCherry-C1質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，完整切下呈線(xiàn)性的pmCherry-C1質(zhì)粒載體，以1%瓊脂糖電泳分離，再以凝膠回收試劑盒回收pmCherry-C1線(xiàn)性載體(約4700bp)。在T4DNA連接酶作用下，將線(xiàn)性pmCherry-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下連接并過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細菌大腸桿菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴增并提取重組質(zhì)粒。
1.3pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒鑒定
1.3.1酶切及基因測序采用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1進(jìn)行單、雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小;同時(shí)對重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序鑒定。
1.3.2融合蛋白檢測采用Westernblotting法。以預冷的1×NP-40裂解液裂解細胞，超聲破碎細胞后4℃、12000r/min離心10min，取上清獲取全細胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、2.5%β-巰基乙醇)，99℃熱變性10min，8%SDS-PAGE電泳;以半干轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3h;加入兔抗人Argonaute1單克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育過(guò)夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根過(guò)氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗室溫孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物后暗室曝光。
1.3.3三色熒光共定位分析以去內毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無(wú)內毒素重組質(zhì)粒。將細胞接種于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞達80%融合時(shí)，進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時(shí)轉染pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒。轉染后48h給予0.5mmol/L亞砷酸鹽處理1h，以4%多聚甲醛室溫固定10min，以高壓過(guò)的PBS緩沖液洗滌2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室溫靜置通透10min;加入1%BSA封閉1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育過(guò)夜;PBS洗滌3次，10min/次;加入藍色熒光標記驢抗鼠(1∶800)與綠色熒光標記驢抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育過(guò)夜;PBS洗滌3次，10min/次。以不含DAPI的細胞熒光封片液封片并過(guò)夜，以激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細胞內紅、綠、藍三色熒光信號。
2結果
2.1Argonaute1目的片段PCR擴增目的片段長(cháng)度約為2574bp。
2.2線(xiàn)性pmCherry-C1質(zhì)粒載體完整的線(xiàn)性pm-Cherry-C1質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，在4722bp左右出現條帶，純化回收后用于后續的連接反應。
2.3重組真核表達質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1鑒定結果
2.3.1酶切及基因測序將構建的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預期相符，重組質(zhì)�；驕y序結果正確，證明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位點(diǎn)上。
2.3.2融合蛋白表達Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量為89.7KDa，Westernblotting法檢測的蛋白條帶與目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表達成功。
2.3.3三色熒光共定位轉染構建的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在細胞內發(fā)現熒光信號，當細胞受到氧化應激時(shí)Cherry-Argonaute1可在胞質(zhì)內形成紅色的顆粒狀結構，與SGs的標志蛋白G3BP(藍色)、PBs的標志蛋白DCP1α(綠色)顆粒結構均呈共定位關(guān)系。
3討論
Argonaute1蛋白家族是一類(lèi)相對分子量約為100KDa的序列保守蛋白，表達于人、果蠅、擬南芥等多個(gè)物種。Argonaute1蛋白家族包括多個(gè)成員，多含有月牙狀的PAZ和具有潛在核酸內切酶活性的PIWI結構域，參與miRNA、siRNA、piRNA等多個(gè)非編碼小RNA的細胞生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現，Argonaute1是RNA誘導沉默復合體的核心元件，與siRNA生成、靶mRNA降解、細胞應激等過(guò)程密切相關(guān)。生物體的生存環(huán)境復雜多變，機體細胞為應對氧化應激、滲透壓休克、熱休克、紫外線(xiàn)輻射和病毒感染等多種外界刺激而建立相應的“應激反應體系”，以保持細胞旺盛的生命力。轉錄后基因調控機制是其中至關(guān)重要的環(huán)節，它可調控胞質(zhì)內RNA代謝、暫時(shí)抑制應激細胞中蛋白的翻譯過(guò)程、節省細胞內合成代謝的原料和能量、優(yōu)先表達應激所特需的蛋白等。SGs和PBs是細胞受到應激時(shí)在胞質(zhì)內形成的與RNA代謝密切相關(guān)的顆粒狀結構。這兩種顆粒結構實(shí)質(zhì)上是一系列蛋白、核酸的聚集體。隨著(zhù)研究的深入，不斷有新的應激蛋白被發(fā)現。
其中，Argonaute1蛋白同時(shí)參與細胞中SGs和PBs的形成。通過(guò)基因工程的方法對Argonaute1蛋白進(jìn)行熒光蛋白標記，可用于探討Argonaute1蛋白在細胞應激中的作用。Cherry是四聚體Discosomasp.紅色熒光蛋白的一個(gè)突變體，熒光強度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1載體允許目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成紅色熒光標記的目的蛋白。本研究通過(guò)構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的方法對Argonaute1蛋白進(jìn)行Cherry的熒光標記。在Westernblotting實(shí)驗中發(fā)現，利用抗內源性Argonaute1抗體可以檢測出兩個(gè)條帶，而抗Cherry抗體檢測出一個(gè)條帶，表明pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒能夠在活細胞內成功表達Cherry與Argonaute1的融合蛋白。當細胞受到亞砷酸鹽氧化應激刺激時(shí)，Cherry標記的Argonaute1蛋白可與應激顆粒(以G3BP蛋白為標記蛋白)和加工體(以DCP1α為標記蛋白)均呈共定位關(guān)系，說(shuō)明Argonaute1蛋白為細胞應激和加工體的共同成員。
總之，本研究成功構建了重組pmCherry-C1-Argonaute1質(zhì)粒，其可有效表達Cherry標記的Argonaute1融合蛋白;上述結果有助于深入研究Argonaute1蛋白在細胞應激及相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的生物學(xué)作用機制。
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