黃芩有效成分在炎癥通路中的作用靶點(diǎn)研究進(jìn)度論文
炎癥反應作為一種基本病理過(guò)程與許多常見(jiàn)炎癥性疾病有著(zhù)密切的聯(lián)系，并且隨著(zhù)現代研究的不斷深入，越來(lái)越多影響人類(lèi)健康的疾病如高血壓、糖尿病、癌癥等也逐漸被發(fā)現與炎癥反應有著(zhù)密切的聯(lián)系。中藥黃芩來(lái)源于唇性科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensis 的干燥根，是一種十分常見(jiàn)的中藥材，在我國有著(zhù)悠久的使用歷史，它始載于《神農本草經(jīng)》，性味苦寒，有清熱燥濕之功效，主要用于濕熱證，證見(jiàn)發(fā)熱胸痞、食欲不振、小便短少、舌苔黃膩等。黃芩的化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等。其活性成分主要為黃酮類(lèi)化合物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、新黃芩素等，研究表明它們都具有一定的抗炎作用，能夠減少腫瘤壞死因子-α( TNF-α) ，白細胞介素-1β( IL-1β) 等重要炎癥介質(zhì)的釋放并且抑制細胞毒性分子一氧化氮( NO) 的產(chǎn)生，從而對機體產(chǎn)生保護作用。近年來(lái)通過(guò)對黃芩抗炎作用的不斷研究，黃芩有效成分的抗炎作用機制也逐漸被人們所掌握，其中就包括對炎癥通路的阻斷作用，黃芩中多種有效成分能夠作用于炎癥通路中的關(guān)鍵靶蛋白影響其活性從而抑制炎癥反應的發(fā)生，但在眾多研究中，研究者往往僅從單個(gè)蛋白或者單條通路探討黃芩有效成分對其中的影響，缺乏一定的整體性。本文從黃芩有效成分在炎癥通路中的作用為出發(fā)點(diǎn)，就黃芩有效成分在整個(gè)炎癥通路中作用的靶蛋白做一個(gè)較為全面的總結，為黃芩抗炎作用的進(jìn)一步研究與應用提供參考。
1 對TLR 通路的影響
Toll 樣受體蛋白( Toll-like receptors，TLR) 最初是在果蠅體內發(fā)現的一種信號轉導蛋白，在果蠅的發(fā)育和免疫反應中有重要的作用。隨著(zhù)研究的不斷深入，人們發(fā)現在哺乳動(dòng)物體內也同樣存在著(zhù)Toll 樣受體蛋白，并將這種蛋白統一歸為T(mén)LR 家族。它們能夠結合一些病原體或其產(chǎn)物共有的特定分子結構來(lái)進(jìn)行識別，還可以對不同病原體的相關(guān)分子結構進(jìn)行識別繼而引發(fā)一系列的信號轉導，從而導致炎癥介質(zhì)的釋放，并最終激活獲得性免疫反應�，F代研究表明中藥黃芩的有效成分能夠作用于TLR 通路的多個(gè)靶蛋白，從而抑制炎癥反應，減少炎癥介質(zhì)的釋放。
1. 1 對TLR2 和TLR4 蛋白的抑制作用作為T(mén)LR
家族的一員，TLR2 和TLR4 的激活可誘導很強的免疫反應，在炎癥正反應中起著(zhù)重要的作用，是天然免疫反應和獲得性免疫反應之間的關(guān)鍵鏈接因子。多項研究表明黃芩苷能夠抑制多種炎癥疾病引起的老鼠體內TLR2 和TLR4 蛋白表達升高，并抑制其相關(guān)基因的表達。Hou 等在對細胞研究中還證實(shí)黃芩苷還能夠減少缺氧引起的大鼠小膠質(zhì)細胞中TLR4 mRNA 表達上升進(jìn)而減少TNF-α， IL-1β， IL-6等炎癥因子的釋放。另?yè)䦂蟮傈S芩的另一成分漢黃芩苷也同樣被證實(shí)能抑制致炎因子LPS 導致的TLR4 蛋白的異常表達。這些均表明TLR 蛋白可能為黃芩抑制炎癥反應的作用靶點(diǎn)。
1. 2 對MYD88， IRAK，TAK 蛋白的抑制作用
髓樣化因子88( MyD88) 是MyD88 依賴(lài)性TLR 信號通路中的一個(gè)主要接頭蛋白，C 端為T(mén)IR 結構域，可與白介素-1 受體相關(guān)激酶( interleukin-1 receptorassociatedkinase，IRAK) 和白介素-8 受體( IL-8receptor，IL-8R) 的TIR 結構結合，N 端是死亡結構( DD) 負責招募下游具有死亡結構的信號分子。在TLR 識別相應配體后，MyD88 與TLRs 互相作用，此時(shí)MyD88 的C 端TIR 結構與受體結合，N 端的DD結構招募IRAK-1， IRAK-4 和腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6 ( tumor necrosis factor receptor-associatedfactor 6，TRAF6) 到受體上，使IRAK-1，TRAF-6 活化進(jìn)而發(fā)生磷酸化，而后與MyD88 解離。在TRAF-6和Ubc13 /Uevl A 的共同催化下TRAF6 自身發(fā)生泛素化，泛素化的TRAF6 通過(guò)轉化生長(cháng)因子β 激活激酶( TGF-activated kinase，TAK) 的介導下激活下游的相關(guān)信號通路調控IL-1， IL-6 和TNF-α 等相關(guān)炎癥因子的轉錄。Lin 等通過(guò)對腎臟缺血模型Wistar 大鼠給予100，10，1mg·kg - 13 種不同劑量黃芩苷，然后使用蛋白質(zhì)免疫印跡( Western bolt) 技術(shù)對大鼠腎臟中MyD88 蛋白分子進(jìn)行檢測，結果顯示3 種劑量的黃芩苷組對比模型組大鼠體內MyD88蛋白表達量有不同程度的下降，由此證明黃芩苷能夠抑制MyD88 蛋白的表達。與此同時(shí)研究人員在對脂多糖( LPS) 致炎的研究過(guò)程中進(jìn)一步發(fā)現黃芩苷還能夠抑制LPS 導致的細胞中IRAK1，TAK1 蛋白的表達上升。黃芩也因此可能以MyD88，IRAK，TAK 蛋白作為靶蛋白，阻斷炎癥通路，從而減少炎癥因子的釋放。
2 對促分裂素原活化蛋白激酶( mitogen-activatedprotein kinases，MAPK)
通路的影響MAPK 通路是炎癥調控中的一個(gè)重要信號通路。這條通路由三類(lèi)蛋白激酶組成，包括MAP 激酶，MAPK 激酶以及MEK 激酶，通過(guò)這三類(lèi)蛋白的依次磷酸化信號就從上游傳遞至下游的應答分子產(chǎn)生相應的應答反應。通過(guò)現代研究，筆者又在哺乳動(dòng)物的體內發(fā)現了細胞外調節蛋白激酶( extracellular regulated protein kinases，ERK) ，c-junN 端激酶( c-jun N-terminal kinase， JNK) ，P38MAPK等五種不同的MAPK 信號通路，它們參與應激刺激、細菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細胞反應，因此MAPK 的激活與炎癥反也有著(zhù)密切關(guān)系。
2. 1 對Raf，MEK1 /2 以及ERK1 /2 蛋白的抑制作用
Raf 是ERK 通路中一個(gè)相對分子質(zhì)量為40 ～75 kD 的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為一種MEK 激酶。當細胞外刺激與相應受體結合后Ras 活化，活化的Ras 作為銜接蛋白與Raf 結合，將Raf 由原來(lái)的細胞質(zhì)中轉移到細胞膜上。Raf 被Raf 激酶激活然后與MAPK 激酶MEK 蛋白結合，從而使MEK 激活，而MEK 的激活又能夠活化ERK 進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的轉錄表達。有明確報道顯示中藥黃芩中的有效成分黃芩素能夠抑制c6 大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白的磷酸化表達升高，提示了黃芩以Raf-1 蛋白和MEK-1 蛋白作為靶點(diǎn)作用于炎癥通路的可能。在有關(guān)人類(lèi)HCC 細胞系mhcc97h 癌細胞的實(shí)驗中Chen 等證實(shí)，不同濃度的`黃芩素均能夠抑制癌癥細胞中ERK1 /2 的磷酸化上升。為黃芩通過(guò)ERK1 /2 為靶蛋白作用于炎癥反應又提供了新的依據。
2. 2 對c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminalkinase，JNK)
蛋白的抑制作用JNK 作為MAPKs 家族中的一員同樣能夠被環(huán)境中的各種應激因素所激活。激活的JNK 可調控許多基因的半衰期，從而增強這些基因mRNA 的翻譯過(guò)程，從而對蛋白的表達進(jìn)行調控。Luo 等的研究還表明，在使用LPS 刺激人類(lèi)口腔黏膜角朊細胞( Hoks) 后細胞中JNK 蛋白的磷酸化明顯上升，然而使用黃芩苷對細胞進(jìn)行與處理后LPS 引起的細胞中各個(gè)時(shí)間段上的JNK蛋白磷酸化上升得到了很好的抑制，并通過(guò)ELISA技術(shù)檢測分析進(jìn)一步發(fā)現相關(guān)炎癥因子IL-6， IL-8等表達量對比未給藥組明顯減少。證實(shí)了JNK 為中藥黃芩在炎癥通路上的作用靶點(diǎn)的可能性。在此基礎上研究者通過(guò)初級星行角質(zhì)細胞，RAW264. 7小鼠巨噬細胞的細胞試驗以及癲癇大鼠黃芩的體外實(shí)驗中進(jìn)一步證明了此結論。
2. 3 對p38 蛋白的抑制作用
p38MAPK 是MAPK家族控制炎癥反應的重要成員，它可以受各種應激刺激而被激活。當p38 被激活后會(huì )發(fā)生核轉位進(jìn)而使多種蛋白激酶和轉錄因子磷酸化和激活，因此筆者可以通過(guò)抑制p38 蛋白的表達與磷酸化，來(lái)對炎癥反應進(jìn)行抑制。在人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 細胞中，細胞因受到應急刺激p38蛋白被激活，其磷酸化水平因此發(fā)生升高。Chen等采用黃芩素干預培養人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎成纖維樣滑膜細胞( RAFLs) 后，通過(guò)Western blot 檢測技術(shù)對p38 蛋白磷酸化變化進(jìn)行檢測。結果證明黃芩素能夠有效的減少p38 磷酸化表達上升，從而阻斷炎癥通路減少炎癥因子IL-1β 的釋放，抑制炎癥反應的發(fā)生。并且這種抑制作用在體外動(dòng)物實(shí)驗方面也表現出了相同的趨勢。Mao 等對癲癇大鼠連續給予黃芩素后對大鼠體內p38 磷酸化蛋白進(jìn)行檢測，結果顯示，黃芩素給藥組對比模型組大鼠體內p38 磷酸化水平出現降低。并且中藥黃芩的另一種重要成分漢黃芩素對p38 磷酸化的抑制作用也被研究者發(fā)現證實(shí)。
3 對核因子-κB( NF-κB) 通路的影響
NF-κB 蛋白家族是近年來(lái)轉錄因子家族中的新成員，是細胞內重要的核轉錄因子，它幾乎存在與所有類(lèi)型的動(dòng)物細胞中并能夠參與細胞的各種應急刺激，包括炎癥性刺激。在之后研究中筆者又進(jìn)一步發(fā)現了p50，p52，p65，c-Rel 等其他NF-κB 家族成員。NF-κB 蛋白家族成員之間能夠形成多種形式的二聚體。在非活狀態(tài)下NF-κB 與IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ 結合的穩定三聚體) 或前體蛋白聚合的二聚體存在與細胞漿中，當收到多種因素的刺激后IKB 三聚體降解，使NF-κB 上的核定位信號暴露，NF-κB 發(fā)生轉核。與調控基因啟動(dòng)子上的KB 位點(diǎn)結合后啟動(dòng)基因轉錄。研究人員通過(guò)使用LPS 刺激雄性ICR 小鼠后發(fā)現小鼠體內p50 的表達得到上調，而后對疾病小鼠給與10 mg·kg - 1·d - 1黃芩苷進(jìn)行治療，3d 后通過(guò)對比發(fā)現p50 的上調表達對比未給藥組表現出明顯的降低趨勢。于此同時(shí)Chen 等也通過(guò)實(shí)驗發(fā)現黃芩中的另一成分黃芩素還能夠降低人類(lèi)直腸癌細胞HCT116 中p50 蛋白的表達上升。與p50 結合形成二聚體的另一種蛋白p65 則有大量的文獻報道指出，黃芩中的多種成分不僅僅能夠能夠影響p65 的蛋白表達，并且對其磷酸化、入核都有著(zhù)重要的影響作用。從中也顯示出黃芩有效成分通過(guò)影響NF-κB 蛋白二聚體來(lái)抑制炎癥反應的一個(gè)重要線(xiàn)索。與NF-κB蛋白二聚體結合的IKB 三聚體( IKKα， IKKβ， IKKγ結合的穩定三聚體) 對于炎癥信號的傳遞也同樣有著(zhù)重要的作用，研究者通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗發(fā)現中藥黃芩中的黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素，對炎癥通路中IKKα， IKKβ 的磷酸化都有著(zhù)良好的抑制作用。因此筆者猜測黃芩中的多種有效成分可以以NF-κB通路中的多個(gè)蛋白為靶點(diǎn)抑制炎癥信號的傳遞，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而緩解炎癥反應。
4 對酪氨酸激酶( janus kinase，JAK)
轉錄因子( STAT) 通路的影響JAK-STAT 信號通路是一條受細胞因子刺激而發(fā)生傳導的信號轉導通路之一。它能夠參與細胞的很多重要的生物學(xué)過(guò)程，例如細胞的增殖、炎癥反應的調節等。與其他信號通路相比， JAK-STAT 信號通路的傳遞過(guò)程相對比較簡(jiǎn)單。主要有3 個(gè)主要的過(guò)程成，首先當相應受體與細胞因子結合后受體分子發(fā)生二聚化，然后與受體偶聯(lián)的JAK 相互接近并通過(guò)交互的酪氨酸磷酸化作用而發(fā)生活化使JAK激活，最后，激酶JAK 催化結合在受體上的STAT 蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的STAT 蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細胞核內與靶基因結合，調控基因的轉錄。Qi 等人在有關(guān)LPS 刺激RAW264. 7 小鼠巨噬細胞的實(shí)驗中證實(shí)，使用20，40，50 μmol·L - 1黃芩素處理培養細胞24 h 后，細胞對于LPS 引起的JAK1 /2 磷酸化上升與STST1 /3 磷酸化上升都有著(zhù)抵抗作用。從中表現出黃芩素以JAK 蛋白與STTA蛋白為靶點(diǎn)的一些線(xiàn)索。
5 結語(yǔ)與展望
黃芩作為傳統中藥材其有效成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、都已被證實(shí)具有抗炎作用，并且隨著(zhù)對黃芩有效成分抗炎作用研究的不斷深入，黃芩在炎癥通路中的作用也逐漸被人們所關(guān)注，對其作用靶蛋白的描述也逐漸增多，但對于作用于靶蛋白的機制以及作用于靶蛋白強弱的研究仍然甚少，并且研究?jì)H停留在對單個(gè)靶蛋白或者單條通路的研究上，缺乏對整個(gè)炎癥通路作用的研究總結以及比較，但這一部分對于進(jìn)一步闡明中藥黃芩抗炎作用機理有著(zhù)關(guān)鍵的作用，研究者仍需進(jìn)一步努力，對黃芩抗炎的作用機理進(jìn)一步挖掘，為黃芩現代化研究以及新藥研發(fā)提供依據。
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