探討稀土上納米粒子與細胞的相互作用機制論文
上轉換發(fā)光納米材料是一種由低能量的近紅外光激發(fā)發(fā)射出高能量可見(jiàn)光的發(fā)光材料，大部分是鑭系元素摻雜的上轉換納米粒子。上轉換發(fā)光材料有很多獨特的優(yōu)點(diǎn): 毒性小、化學(xué)穩定性高、光穩定性好、發(fā)射和吸收帶狹窄、熒光壽命長(cháng)，另外由近紅外激發(fā)發(fā)光有較深的光穿透深度、對生物樣本和生物組織幾乎無(wú)損傷、無(wú)背景熒光、耐光漂白。這些優(yōu)異的特性使上轉換發(fā)光納米粒子在生物熒光標記染料、藥物載體和以能量共振轉移為基礎的生物檢測等醫用領(lǐng)域得到廣泛的應用。納米粒子安全高效的進(jìn)入細胞是這些應用成功實(shí)現的關(guān)鍵。然而，關(guān)于上轉換發(fā)光納米粒子與細胞相互作用的研究尚未見(jiàn)報道。因此，本文對稀土上轉換發(fā)光納米粒子與細胞相互作用的機制做了初步的研究。
上轉換發(fā)光納米材料中發(fā)光效率最高的是稀土上轉換發(fā)光納米粒子，其中的佼佼者是離子對Yb3 + /Er3 + 或Yb3 + /Tm3 + 摻雜的NaYF4納米粒子。據此，本文選用了兩種類(lèi)型的稀土上轉換發(fā)光納米粒子進(jìn)行研究。第一種是根據文獻報道合成的巰基丁二酸修飾的親水性上轉換NaYF4: Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HMNPs) 。第二種是由本課題組合成的氨基修飾的親水性上轉換NaYF4:Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HINPs) 。這兩種粒子的物理化學(xué)性質(zhì)相近，但表面電荷極性不同。HMNPs 因表面包覆巰基而帶負電，HINPs 因表面接氨基而帶正電。HMNPs 是文獻報道中比較常用的一種稀土上轉換納米粒子因此很具代表性，而帶有正電的HINPs 可以從另一個(gè)角度反映上轉換發(fā)光納米粒子與細胞的相互作用機制。
1 實(shí)驗
1. 1 試劑和儀器
高糖培養基( DMEM) ，胎牛血清( FBS) 和0. 25%胰蛋白酶，Gibco; 1% 雙抗，磷酸緩沖鹽溶液( PBS) ，Hyclone; 曲拉通X-100，Aladdin。GATAN 832. 20B 透射電鏡; RF-5301 熒光分光光度計; Zetasizer Nano Seriesa ZEN4602 納米粒度電位儀; BD FACS Calibur 流式檢測儀; LeicaTCS SP8 共聚焦檢測儀; Dimension Icon，BrukerAXS 原子力顯微鏡。
1. 2 細胞培養
MDA-MB-231 細胞在完全培養基( 高糖基礎培養基∶ 胎牛血清∶ 雙抗= 89∶ 10∶ 1) ，37 ℃，5% CO2的條件下培養。
1. 3 流式細胞檢測
將2 mL 密度為1 × 105 個(gè)·mL - 1 的細胞接種在細胞培養皿中培養10 h，然后將培養基吸掉，用PBS 清洗3 次，加入濃度為100 μg·mL - 1 HINPs 或HMNPs 粒子的分散液，分別放在三種不同的培養條件下培養: 37 ℃( 常規條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100 ( Triton X-100) 。
37 ℃條件下，粒子的分散液是將納米粒子原液添加到完全培養基制得，用其替換原培養基后放在37 ℃，5% CO2的條件下接著(zhù)培養。低溫4 ℃條件下，將粒子原液加入完全培養基得到分散液，用其替換原培養基放在低溫4 ℃的條件下繼續培養。曲拉通X-100 條件下，將粒子原液添加到含曲拉通X-100( 體積分數為0. 0033%) 的完全培養基得到分散液，用其替換原培養基放在37 ℃，5%CO2的條件下繼續培養。
每種條件下細胞都分別繼續培養1，3，5 和10 h，然后將含粒子的培養基吸出，用PBS 清洗3次，用0. 5 mL 0. 25%的胰酶消化4 min，后用2 mL的完全培養基終止消化，將其放入離心管以1000r·min - 1的速度離心5 min 得到細胞，向離心管內加入3 mL PBS 將細胞吹打均勻后再離心5 min，最后將得到的細胞分散在500 μL 的PBS 中做流式檢測。每次至少測量10000 個(gè)細胞后再計算細胞平均熒光強度。
1. 4 共聚焦成像
將2 mL 密度為2. 5 × 104 個(gè)·mL - 1 的細胞懸液接種在含直徑為20 mm 玻片的35 mm 的培養皿中培養，培養方式和培養條件與做流式檢測的實(shí)驗相同，不同之處在最后樣品處理的過(guò)程。細胞在含粒子的培養基中分別培養1，3，5，10 h后，用PBS 清洗3 次，最后向培養皿中加入1 mL 的PBS，接著(zhù)進(jìn)行共聚焦檢測。
1. 5 原子力顯微鏡檢測( AFM)
在研究表面活性劑對上轉換納米粒子與細胞相互作用影響之前，我們先用原子力顯微鏡做了一些前期實(shí)驗來(lái)研究表面活性劑對細胞形態(tài)的影響。培養皿中加入2 mL 密度為3. 25 × 104個(gè)·mL - 1的細胞培養10 h。將培養基替換成含有0. 0033% 曲拉通X-100 的完全培養基繼續培養10 h。用PBS 將細胞清洗3 次，接著(zhù)用3% 的甲醛溶液在4 ℃固定2 h，用PBS 清洗5 次，后依次用10%，30%，40%，60%，70%，80%，90% 和100%的乙醇處理5 min 脫水。最后樣品用原子力顯微鏡進(jìn)行檢測。
2 結果和討論
HINPs 和HMNPs 是平均粒徑為30 nm 的近似六邊形的親水性稀土上轉換發(fā)光納米粒子，HINPs因表面氨基帶正電，HMNPs 因表面巰基帶負電。稀土上轉換發(fā)光納米粒子可以由低能量近紅外光激發(fā)發(fā)射出高能量的可見(jiàn)光，所以進(jìn)行體內或體外的熒光檢測時(shí)，可直接使用上轉換發(fā)光納米粒子而不需要標記熒光染料。由于沒(méi)有熒光染料釋放到體內環(huán)境，所以用這種材料進(jìn)行熒光成像和流式檢測時(shí)會(huì )獲得更準確的數據。雖然HINPs和HMNPs 的表面基團不同，但是濃度相同的HINPs 和HMNPs 溶液由激發(fā)光980 nm 激發(fā)發(fā)射的熒光強度基本相近，所以細胞熒光成像時(shí)不會(huì )因熒光強度的不同造成巨大的成像差異。HINPs 和HMNPs 在三種不同的培養環(huán)境中與細胞相互作用，包括37 ℃( 常規條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100。通過(guò)使用共聚焦成像和流式檢測兩種檢測手段對細胞進(jìn)行表征。
2. 1 HINPs 與細胞相互作用的探究
2. 1. 1 37 ℃常規條件
37 ℃條件下，將細胞放在含有100 μg·mL - 1HINPs 的完全培養基中培養一段時(shí)間。由共聚焦圖3 可以看到，1 h 時(shí)幾乎沒(méi)有HINPs 進(jìn)入細胞，大部分的顆粒粘附在細胞膜上。3 h 后，大量顆粒進(jìn)入細胞，使得細胞熒光強度有了顯著(zhù)提高。5 和10h 后，顆粒更加均勻地分布在細胞內，吸附在細胞膜上的顆粒少。隨著(zhù)時(shí)間的推移，細胞熒光強度整體上有增加的趨勢。通過(guò)使用流式細胞儀對細胞熒光強度做定量檢測，由圖4可知細胞的熒光強度的確隨著(zhù)時(shí)間的推移而增長(cháng)，3 h 內顆粒進(jìn)入細胞的速度最快，此后粒子進(jìn)入細胞的數量增長(cháng)緩慢且逐漸趨于平衡。另外，細胞內有顯著(zhù)的點(diǎn)狀熒光分布格局，可以推論HINPs 是被囊泡包裹進(jìn)入細胞。
2. 1. 2 低溫4 ℃
4 ℃條件下 4 ℃的條件下基本沒(méi)有HINPs 進(jìn)入細胞。根據文獻報道在4 ℃的培養條件下為細胞膜轉運物質(zhì)提供能量的途徑會(huì )受到抑制，從而阻礙胞吞和胞吐等需消耗能量的跨膜運輸方式。因此可以推論出細胞對HINPs 的攝取需要消耗能量。
2. 1. 3 曲拉通X-100
將細胞在含HINPs 和曲拉通X-100 的完全培養基的條件下培養，進(jìn)一步探究HINPs 的轉運是否與膜蛋白有關(guān)。曲拉通X-100 作為一種非離子去污劑，可以破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)以及脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，但不破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的連接，使蛋白質(zhì)從細胞膜上溶解和分離。曾有研究表明當曲拉通X-100 的濃度低于0. 15 mmol·L - 1 時(shí)，細胞膜的通透性沒(méi)有變化且不影響細胞活性。為了證明這一點(diǎn)我們先做了預實(shí)驗，將細胞放在含0. 0033%( 0. 04 mmol·L - 1 ) 曲拉通X-100 的完全培養基中培養10 h，用AFM 進(jìn)行檢測。在沒(méi)有加曲拉通X-100 的空白對照組中，統計了50 處不同位置不同細胞剖面高度的數值，得出對照組細胞膜的平均高度差為81 nm 。在曲拉通X-100 處理過(guò)的實(shí)驗組中，統計了50 處不同位置不同細胞剖面高度的數值，得出對照組細胞膜的平均高度差為193 nm。實(shí)驗組的高度差要遠大于對照組的高度差，說(shuō)明曲拉通X-100 確實(shí)能在細胞保持活性的情況下使細胞膜產(chǎn)生孔洞。將細胞在含HINPs 與0. 0033% 曲拉通X-100的培養基中培養，細胞內看不到綠色熒光與37 ℃ 條件含HINPs 培養基中培養的細胞相比，在僅是添加了曲拉通X-100 的情況下就導致了細胞內沒(méi)有綠色熒光的出現，即無(wú)納米粒子的進(jìn)入。通過(guò)前面對曲拉通X-100 作用的討論可知，雖然細胞膜上出現一些空洞，但細胞仍然�；钚�、細胞膜的.整體構架完整且通透性沒(méi)有變化，由此可推論出曲拉通X-100 主要影響的是膜蛋白的活性，甚至使得膜蛋白與細胞膜分離。因此HINPs 納米粒子未能進(jìn)入細胞，可以理解為由于膜蛋白的失活或缺失而導致納米粒子不能進(jìn)入細胞。因此，膜蛋白在HINPs 的跨膜過(guò)程中有著(zhù)非常重要的作用。
通過(guò)對37 ℃，4 ℃和曲拉通X-100 三種條件的實(shí)驗結果的分析可推出HINPs 進(jìn)入細胞應該先與細胞膜上的受體蛋白結合，導致膜凹陷，繼而形成內吞囊泡進(jìn)入細胞。這一過(guò)程也稱(chēng)為消耗能量的受體介導的胞吞運輸方式。
2. 2 HMNPs 與細胞相互作用的探究
為了從另一個(gè)角度探究上轉換納米粒子與細胞的相互作用，我們采用另一種表面帶負電的HMNPs 納米粒子做相同的實(shí)驗進(jìn)行對比。HMNPs與HINPs 細胞熒光強度的變化在總體趨勢上沒(méi)有明顯的區別。在37 ℃ 條件下培養時(shí)，細胞攝取HMNPs 的量是最大的。在其它情況下基本沒(méi)有粒子進(jìn)入細胞。HMNPs 進(jìn)入細胞的過(guò)程同樣是一種消耗能量的受體介導的胞吞運輸方式。雖然HMNPs 與HINPs 的運輸方式相同，但是由共聚焦看到HMNPs 的細胞熒光強度要比HINPs 的細胞熒光強度弱，即HMNPs 進(jìn)入細胞的量要小于HINPs 的進(jìn)入量。兩種粒子各自相對熒光強度圖，計算方法是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗組與空白對照組的細胞熒光強度相減得到差值，后將每個(gè)差值除以1 h 的差值得到相對強度。這樣排除了粒子熒光發(fā)光強度不同的因素，可以直接定量得出正常條件下細胞對HMNPs 的攝取量的確遠低于對HINPs的攝入量，說(shuō)明帶正電的HINPs 更容易和帶負電的細胞膜結合進(jìn)入細胞。
3 結論
表面包覆氨基而帶正電的HINPs 和包覆巰基帶負電的HMNPs 是兩種典型的稀土上轉換發(fā)光納米粒子。通過(guò)研究發(fā)現，37 ℃條件下這兩種納米粒子在10 h 內進(jìn)入細胞的數量呈逐漸增加的趨勢，并且呈顯著(zhù)的點(diǎn)狀熒光分布。由此表明這些納米粒子是以囊泡包裹的方式進(jìn)入細胞的。低溫4 ℃時(shí)細胞內消耗能量的轉運方式受到抑制而此時(shí)粒子基本未進(jìn)入細胞，說(shuō)明細胞對這些粒子的攝取是消耗能量的過(guò)程。適量曲拉通X-100 能在細胞保持活性的狀態(tài)下使膜蛋白失活甚至脫落，此種條件下也沒(méi)有粒子進(jìn)入細胞，證明膜蛋白在納米粒子的轉運中有著(zhù)重要的作用。綜上所述可推斷HINPs和HMNPs 的跨膜是一種能量消耗的受體介導的胞吞運輸方式。另一方面，帶正電的HINPs 相較于帶負電的HMNPs 更容易與細胞膜相互作用進(jìn)入細胞，表明帶正電的上轉換發(fā)光納米粒子作為運輸藥物的載體會(huì )更有優(yōu)勢。由共聚焦成像和流式檢測可知HINPs 在細胞內受激發(fā)射出很強的熒光，證明這種材料能夠成為優(yōu)異的體內成像材料。通過(guò)對上述研究的分析，我們相信這項工作會(huì )為探究上轉換發(fā)光納米粒子與細胞相互作用的機制開(kāi)啟新思路，為設計安全高效的納米藥物載體和體內成像材料提供實(shí)驗和理論依據。
【探討稀土上納米粒子與細胞的相互作用機制論文】相關(guān)文章：
民辦職教發(fā)展機制建構途徑探討論文05-25
酒店管理中的激勵機制探討論文01-14
淺析沙門(mén)菌效應蛋白對宿主細胞的影響及分子機制論文07-17
職業(yè)教育校企合作機制探討論文11-18
社會(huì )消防安全管理機制探討論文01-06
水利管理體制與運行機制的探討論文12-27
縣域資金回流機制探討01-20