分離培養及鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的方法探析論文

　　骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）也被稱(chēng)為間質(zhì)祖細胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認為是再生醫學(xué)、基因治療和細胞治療的理想種子來(lái)源，已被廣泛進(jìn)行研究[1-3].目前，BMSCs在動(dòng)物實(shí)驗和臨床應用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)膠質(zhì)修復、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干細胞和異基因干細胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問(wèn)題，有利于細胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在體外分離純化、培養擴增來(lái)滿(mǎn)足臨床應用和實(shí)驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養有很大的影響[8].本試驗通過(guò)觀(guān)察2種不同分離方法和不同首次換液時(shí)間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實(shí)驗提供基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1實(shí)驗動(dòng)物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由河南省實(shí)驗動(dòng)物中心提供。

　　1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細胞裂解液（北京賽馳生物技術(shù)有限公司）；生物素標記山羊抗兔IgG、HRP標記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。

　　HF151UV型CO2培養箱（Heal Force）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng)；數碼相機：日本佳能IXUS 980IS;電子天平：METTLER TOLEDO AL104;超凈工作臺：AIR TECH;FX101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；pH計：上海雷磁儀器廠(chǎng)。

　　1.3 BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復沖洗，剪斷兩側干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養液反復沖洗骨髓腔于A(yíng)、B兩個(gè)10mL的離心管內，直至骨髓腔發(fā)白，1 000r/min離心5min,棄上清。

　　1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細胞，1 000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個(gè)25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養。以后每3d換液1次，待細胞生長(cháng)融合至80%時(shí)傳 代 培 養。 先 棄 去 舊 培 養 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)。

　　1.5紅細胞裂解法B管加入1mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置1~3min,待液體由紅色變?yōu)榘咨�后，�?入5 mL PBS液，1 000r/min離 心2次，5min/次，棄 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個(gè)25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養。

　　2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細胞生長(cháng)融合至80%時(shí)傳 代 培 養。 先 棄 去 舊 培 養 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)。

　　1.6兔BMSCs細胞活性檢測及生長(cháng)曲線(xiàn)繪制培養48h時(shí)，各取一瓶細胞，棄去培養基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺盼藍染色，血球計數板計數活細胞（未著(zhù)色）和死細胞（著(zhù)色細胞）。分別計算出2種不同分離方法的細胞活性。上述試驗重復3次。

　　選取生長(cháng)良好的P1、P3和P8代細胞，以2.0×104個(gè)/孔，接種于24孔培養板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計數，取其平均值為當天的細胞數，連測8d,以培養時(shí)間為橫坐標，細胞數為縱坐標，繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。

　　1.7首次換液時(shí)間對兔BMSCs的影響將用紅細胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時(shí)間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組0~3代各代培養時(shí)間，各代細胞均保留3瓶。

　　1.8細胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細胞裂解法的P3代細胞，制備細胞爬片，常規SABC免疫組織 化 學(xué) 方 法 檢 測 表 面 抗 原CD34、CD、CD45、CD90的表達。

　　1.9統計學(xué)處理所得數據以均數±標準誤表示，應用SPSS16.0統計學(xué)軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel軟件作圖。

　　2 結果

　　2.1不同分離方法對兔BMSCs形態(tài)和生長(cháng)的影響

　　剛接種時(shí)，2種不同分離方法所得的原代細胞在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞呈圓形，大小一致，折光性強，不容易區分。培養48h后，A、B兩組細胞均可看見(jiàn)有圓形、短梭形、多角形細胞貼壁。

　　B組貼壁細胞較A組細胞多（圖1）。臺盼藍染色檢測細胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細胞裂解法（B組）為96%.隨著(zhù)培養的繼續，大量細胞貼壁，并出現典型的BMSCs細胞集落，緊密排列。

　　A組細胞生長(cháng)較緩慢，所得細胞純度較低；B組細胞生長(cháng)較快，純度較高。原代細胞達到傳代的時(shí)間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著(zhù)（P<0.05）。B組細胞P3代細胞呈旋渦狀或放射狀生長(cháng)，細胞形態(tài)大小均一（圖2）.

　　2.2兔BMSCs生長(cháng)曲線(xiàn)繪制

　　通過(guò)細胞計數法繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)，對兔BMSCs的生長(cháng)特性進(jìn)行鑒定。結果顯示，P1、P3、P8代細胞培養過(guò)程中，細胞生長(cháng)具有相似的特點(diǎn)：1~2d細胞處于潛伏期；3~6d細胞處于對數生長(cháng)期；6~8d生長(cháng)逐漸減慢，開(kāi)始進(jìn)入平臺期（圖3）。傳代細胞生長(cháng)相對穩定，隨著(zhù)傳代次數的增加，細胞會(huì )出現衰老的特征，增殖速度減慢。

　　2.3兔BMSCs的鑒定

　　結果顯示，CD44、CD90抗原表達陽(yáng)性，CD34抗原表達陰性（圖4），符合BM-SCs表面分子標記特征。

　　2.4首次換液時(shí)間對兔BMSCs培養周期的影響紅細胞裂解法分離兔BMSCs,分別在12,24,48,72h首次換液，結果（表1）顯示，24h換液組P0、P1、P2、P3代以及總時(shí)間的細胞培養時(shí)間與其他各組比較差異極顯著(zhù)（P<0.01），表明24h首次換液可縮短細胞培養周期。

　　3 討論

　　骨髓中BMSCs的含量很低，一般為0.001%~0.010%,其數量和生長(cháng)能力與年齡呈顯著(zhù)負相關(guān)，想要在臨床實(shí)踐中利用BMSCs,就必須實(shí)現其在體外的分離培養和擴增。目前，常用的BMSCs的分離和純化方法有：全骨髓貼壁法、紅細胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分選法和流式細胞術(shù)分選法，后2種方法篩選BMSCs的分選效率和純度均較高，但是對實(shí)驗條件和設備要求較高，費 用 昂 貴，并 且BMSCs表面缺乏特異性標志，在具體操作過(guò)程中可造成細胞的損傷和死亡，所以較少使用[9].密度梯度法由于分離液往往對BMSCs有一定的損傷，且離心會(huì )丟失大量的細胞，對細胞活性有影響，因此應用受到很大限制[10].本試驗通過(guò)比較全骨髓貼壁法和紅細胞裂解法，發(fā)現2種分離方法均可得到較均一的長(cháng)梭形細胞，聚集成旋渦狀均勻生長(cháng)。但是紅細胞裂解法分離得到的BMSCs在48h時(shí)貼壁細胞顯著(zhù)多于全骨髓貼壁法，并且細胞活性較高，細胞密度達到80%融合，首次傳代時(shí)間也較短。這可能是因為全骨髓貼壁分離法保留了造血干細胞和其他雜細胞，在體外培養過(guò)程中混雜的細胞會(huì )對BMSCs的生長(cháng)及貼壁產(chǎn)生影響，所得BMSCs純度和細胞活性均較低；而紅細胞裂解液的有效成分是氯化銨，能夠利用紅細胞的滲透脆性特異性的破壞無(wú)核紅細胞膜而去除紅細胞和血小板，并且對有核細胞無(wú)影響，從而去除骨髓中含量最高的細胞成分，經(jīng)紅細胞裂解液處理后，減小了雜細胞對其貼壁的影響，為BMSCs貼壁保留了空間，有利于BMSCs的早期貼壁[11],所得細胞純度高，且細胞活力不受影響。因此，利用紅細胞裂解法，能夠在較短的時(shí)間里獲得大量的高純度、高活性的目的細胞，是一種有效的分離純化BMSCs的方法。

　　有研究表明，首次換液時(shí)間對BMSCs的生殖增長(cháng)有一定的影響。原代首次換液時(shí)間過(guò)早，由于骨髓沖洗液中其他細胞分泌滋養BMSCs的生長(cháng)因子等多種有益成分丟失，貼壁細胞數量減少，細胞生長(cháng)緩慢，細胞培養周期延長(cháng)；原代首次換液時(shí)間過(guò)晚，雜質(zhì)貼壁緊密，細胞代謝產(chǎn)物等有害成分增多，造血干細胞分泌的生長(cháng)因子使BMSCs出現分化等，從而導致細胞增殖周期延長(cháng)。本試驗分別在12,24,48,72h首次換液，24h換液組，首次傳代時(shí)間及細胞培養總周期與其他各組比較，差異有顯著(zhù)性意義，能顯著(zhù)縮短細胞培養時(shí)間，因此，培養24h首次換液為最佳首次換液時(shí)間。

　　BMSC目前還沒(méi)有發(fā)現特異性的表面標記物，其鑒定尚無(wú)統一標準。

　　BMSC的表面抗原具有非專(zhuān)一性，表達內皮細胞、間質(zhì)細胞、表皮細胞和肌肉細胞的表面標志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整 合 素 家 族 成 員CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表達造血干細胞表面標志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,結 果 顯 示，BMSCs陽(yáng) 性 表 達CD90和CD44,造 血 干 細 胞 標 志CD34呈 陰 性 表 達，符 合BMSCs的表面標志物特征，證實(shí)我們體外分離培養的細胞為純化的BMSCs.

　　綜上所述，通過(guò)紅細胞裂解液法分離得到的兔BMSCs生長(cháng)增殖旺盛，生物學(xué)性狀穩定，于培養24h首次換液可顯著(zhù)縮短細胞的培養周期，便于后續的試驗研究。

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