紙層析的實(shí)驗報告

　　篇一：紙層析法分離氨基酸實(shí)驗報告

　　前言

　　紙層析法 紙層析法又稱(chēng)紙色譜法，是目前廣泛應用的一種分離技術(shù)。本世紀初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素�，F在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。它是一種以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動(dòng)相為不與水相溶的有機溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開(kāi)。當組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。根據組分移動(dòng)距離（Rf值）與已知樣比較，進(jìn)行定性。用斑點(diǎn)掃描儀或將組分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。

　　紙層析法（paper chromatography）是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。紙層析法是用濾

　　紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動(dòng)相。

　　在環(huán)境分析測試中，有時(shí)用紙層析法分離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC應用普遍。在

　　做葉綠體色素分離時(shí)用到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀(guān)查出各種色素的相對含量和種類(lèi)。

　　紙層析法一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素分離。

　　氨基酸 氨基酸是構成蛋白質(zhì)的基本單位，廣泛用于食品、醫藥、添加劑及化妝品行業(yè)。隨著(zhù)生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展逐漸成為2l世紀全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來(lái)越大，品種變更越來(lái)越快，工藝改革越來(lái)越新。目前全世界氨基酸每年的產(chǎn)量為100萬(wàn)噸，而需求總量是800萬(wàn)噸。我國自20世紀60年代起，氨基酸的應用在食品工業(yè)占61％，在飲料工業(yè)占30％，醫藥、日用化工、農業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。

　　氨基酸在人類(lèi)生活的很多方面都有著(zhù)應用：

　　(1)在食品行業(yè)的應用

　　(2)在醫藥工業(yè)的應用

　　(3)在飼料添加劑行業(yè)的應用

　　(4)在化妝品行業(yè)的應用

　　(5)在農業(yè)上的應用

　　(6)在其他行業(yè)的應用

　　氨基酸工業(yè)還有著(zhù)廣闊的發(fā)展前景：

　　(1)傳統的氨基酸生產(chǎn)方法

　　(2)運用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸

　　(3)大力發(fā)展藥用中間體,具體為：

　�、侔被�酸及其衍生物逐漸成為藥用中間體

　�、诜翘烊话被�酸是合成活性藥物的重要原料

　�、凵�產(chǎn)高附加值的非天然氨基酸

　　一、實(shí)驗目的

　　(1)掌握分配層析的原理，學(xué)習氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色）。

　　(2)學(xué)習未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。

　　二、實(shí)驗原理

　　(1)紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動(dòng)相。當有機相流過(guò)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。

　　(2)溶質(zhì)在濾紙上的`移動(dòng)速度用比移值Rf值表示。

　　(3)Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。

　　(4)在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數。Rf值的大小與物質(zhì)的結構、性質(zhì)、溶劑系統、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗利用紙層析法分離氨基酸。材料與方法

　　三、實(shí)驗裝置與試劑

　　(1)氨基酸標準液(1mg/ml)

　　亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標準液。

　　(2)80%甲醇

　　(3)0.1%茚三酮丙酮溶液

　　(4)氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)

　　(5)正丁醇

　　實(shí)驗儀器

　　(1)新華濾紙×1

　　(2)培養皿×1

　　(3)電熱鼓風(fēng)干燥箱×1

　　(4)吹風(fēng)機×1

　　(5)毛細管×4

　�。�6）針、線(xiàn)、尺×1

　�。�7）鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)×1

　　實(shí)驗操作

　　(1)濾紙

　　選用國產(chǎn)新華 1號濾紙， 6cm×7cm。在距濾紙2cm處劃線(xiàn)，用

　　鉛筆在線(xiàn)上標上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出縫線(xiàn)空間）。

　�。�2）點(diǎn)樣

　　點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴散或拉長(cháng)，以致分離不清。用毛細管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的擴散直徑控制在0.5cm之內，點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機吹干，但要注意溫度不可過(guò)高，以免氨基酸破壞，影響定量結果。 將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側比齊，用線(xiàn)縫好，揉成筒狀。注意縫線(xiàn)處紙的兩邊不要接觸。避免由于毛細管現象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。

　　(3)展層

　　將揉成圓筒狀的濾紙放入培養皿內 (注意濾紙不要碰皿壁)，當溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標出溶劑前沿位置。

　　酸溶劑系統：

　　正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml。溫度25℃，時(shí)間1h。

　　注意：使用的溶劑系統需新鮮配制，并要搖勻。

　�。�4）顯色

　　待展層基本結束后, 置65℃鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。

　�。�5）Rf值的計算

　　篇二：氨基酸的薄層層析實(shí)驗報告

　　實(shí)驗六 紙層析法觀(guān)察轉氨基作用

　　【實(shí)驗名稱(chēng)】：紙層析法觀(guān)察轉氨基作用

　　09救援一班  第三大組  李嵐宇  2009222336

　　室溫：28°

　　（一）實(shí)驗目的：

　　1、學(xué)習氨基酸紙層析的基本原理。

　　2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。

　　（二）實(shí)驗原理：

　　轉氨基作用是氨基酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要反應，在轉氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸與α-酮基的互換反應稱(chēng)為轉氨基作用。轉氨基作用廣泛地存在于機體各組織器官中，是體內氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應時(shí)均由專(zhuān)一的轉氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基轉移到另一α－酮基酸上。各種轉氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）催化如下反應：

　　α—酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 +  丙酮酸

　　本實(shí)驗以丙氨酸和α-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現，以證明轉氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機溶劑與水不相溶，把預分離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著(zhù)流動(dòng)相的移動(dòng)進(jìn)行連續、動(dòng)態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數的差異，而使移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢較大的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢，反之，在流動(dòng)相分配趨勢較大的成分，移動(dòng)速度快，最終不同的組分彼此分離，物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比值Rf表示： ALT

　　物質(zhì)在一定的溶液中的.分配系數是一定的，故比值Rf也相對穩定，因此在同一層析體系中可用Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。

　　（三）實(shí)驗材料與儀器：

　　試劑：

　　1、0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。

　　2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml與0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。

　　3、0.1mol/L丙氨酸溶液稱(chēng)取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 N NaOH仔  細調至pH7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。

　　4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸稱(chēng)取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細調至pH 7.4 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。

　　5、0.1mol/L 谷氨酸溶液稱(chēng)取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細調至pH 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。

　　6、0.5%茚三酮溶液稱(chēng)取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。

　　7、層析溶劑：將重蒸過(guò)的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時(shí)后分層，將下部酚層轉移到瓶中備用。

　　儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養皿、表面皿、沸水浴鍋、37℃恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。

　　（四）實(shí)驗步驟:

　　1、肝勻漿制備：取新鮮動(dòng)物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿， 用上述緩沖液4.5ml混勻備用。

　　2、 酶促反應過(guò)程

　�。�1）取離心管兩支，編號：1（測定管）、2（對照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。

　�。�2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。

　�。�3）37℃保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。

　�。�4）把測定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過(guò)濾。

　　3、層析

　�。�1）取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點(diǎn)為中心，約1 cm為半徑,用鉛筆劃一圓線(xiàn)作為基線(xiàn),在線(xiàn)上四等份處標清四點(diǎn)編號作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。

　�。�2）點(diǎn)樣：用四根毛細玻璃管分別進(jìn)行點(diǎn)樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點(diǎn)在原點(diǎn)2、4處。把測定液、對照液分別點(diǎn)在原點(diǎn)1、3處。注意斑點(diǎn)不宜過(guò)大（應在直徑0.5cm以下）。在第一次點(diǎn)樣點(diǎn)干后，再在原處同樣點(diǎn)第2次。

　�。�3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。

　�。�4）把濾紙平放在上述培養皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養皿蓋�？梢�(jiàn)層析液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周擴散。當層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時(shí)，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。

　�。�5）顯色：將上述濾紙平放在培養皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤，再放入烘箱干燥，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑出現，比較色斑的位置，及色澤深淺，計算Rf值，分析是否發(fā)生了轉氨基反應。

　　（五）實(shí)驗結果記錄：

　　（六）實(shí)驗討論：

　　1、從表格（1）中可以看出，測定管上清液點(diǎn)樣出現了兩個(gè)色斑，根據Rf值的計算也可以看出，測定管中氨基酸發(fā)生了轉氨基作用，生成的未知物質(zhì)b為谷氨酸，則未知溶質(zhì)a為丙氨酸；對照管中因為酶的失活而沒(méi)有發(fā)生轉氨基反應，只有丙氨酸，所以色斑只有一個(gè)。

　　2、層析點(diǎn)樣時(shí)手要洗凈，操作中盡可能少量接觸濾紙，以免污染。

　　3、層析液中含有腐蝕性酚，取用時(shí)注意安全，防止濺到皮膚及眼睛。

　　4、點(diǎn)樣點(diǎn)不宜過(guò)大，直徑小于0.5cm.

　　2010年9月19日

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