紫心甘薯多糖的分離及組分抑癌活性研究的論文
天然活性多糖是一類(lèi)結構復雜的生物大分子物質(zhì)，作為植物細胞壁的結構成分廣泛存在于自然界中，具有機體免疫調節、抗氧化、降血糖血脂等作用近年來(lái)，多糖研究日益受到人們的關(guān)注。目前，實(shí)驗室常用熱水浸提和低溫堿提兩種方法來(lái)獲得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用熱水浸提所得的天然植物多糖（如人參多糖）經(jīng)純化在體內外均具有一定的抗腫瘤活性0,也有報道紫心甘薯水提粗多糖在體內有一定的抑瘤效果,但尚未見(jiàn)到關(guān)于紫心甘薯多糖分離及組分抑癌研究的相關(guān)報道。本研究結合浙江省臨安市太陽(yáng)鎮紫心甘薯基地的開(kāi)發(fā)課題，以紫心甘薯“渝紫263”為材料,通過(guò)低溫堿提獲得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖組分的分離條件,并借助體外細胞實(shí)驗和紅外光譜等檢測手段初步探究紫心甘薯多糖的結構成分及組分的抑癌作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用紫心甘薯提供理論指導和實(shí)驗依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗材料與試劑紫心甘薯，由浙江省臨安市太陽(yáng)鎮紫心甘薯實(shí)驗基地提供;腫瘤細胞株Hela、HepG:,由浙江大學(xué)醫學(xué)院提供；DEAE-Cellulose,華東醫藥試劑；CM-Cellulose,華東醫藥試劑；SephacrylS-t00,美國GE公司;D-葡萄糖醛酸，國藥集團試劑；咔唑，中國遠航試劑;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（臨用時(shí)用PBS配置成5mg/ml溶液，分裝避光-20°C保存）；DMSO,Sigma公司；
標準單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、濃硫酸、甲苯胺藍等試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.2主要儀器AKTAprimeplus層析系統，美國GE公司；LDR44.4C低速冷凍離心機，北京醫用離心機廠(chǎng)；高速冷凍離心機,BECKMANCOULTER；可見(jiàn)分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；RE-2000旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；電子天平，德國IKA;磁力攪拌器，IKARHbasicl;紅外光譜儀470FT-IR,NEXUS公司；倒置顯微鏡，OLYMPUS；二氧化碳培養箱，美國FormaScientific公司；516MC酶標儀，國產(chǎn);各種尺寸層析柱，上海華美實(shí)驗儀器廠(chǎng);薄層層析硅膠板,浙江臺州；真空干燥裝置,上海一恒科技有限公司；層析缸，國產(chǎn)。
1.2方法
1.2.1紫心甘薯多糖提取參見(jiàn)文獻0。甘薯洗凈、去皮、烘干后粉碎；用3倍體積95%乙醇于80C水浴中回流脫脂2h,重復一次，晾干后在70C水浴中水提2h,離心分離上清液,殘渣重復操作一次;合并上清液，濃縮,三氯乙酸法除蛋白，用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；無(wú)水乙醇、丙酮反復洗滌；將沉淀在低溫下用10%NaOH以1:10的比例進(jìn)行堿提，濃縮，蒸餾水透析48h;用3倍體積85%乙醇沉淀多糖；離心取沉淀，用無(wú)水乙醇反復洗滌；真空烘干后得PPSP粗多糖。
1.2.2多糖標準曲線(xiàn)繪制苯酚4硫酸法檢測糖含量，以葡萄糖為標準單糖,繪制葡萄糖標準曲線(xiàn);硫酸咔唑法檢測糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸為標準品,繪制糖醛酸含量測定標準曲線(xiàn)。1.2.3離子交換層析參見(jiàn)文獻_。離子交換柱的選擇：配置0.05mol/LPBS緩沖液（K2HPO4-CH2PO4),再用此緩沖液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纖維素微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30min。將處理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分別裝柱（2.6X30cm),用3倍柱體積的緩沖液平衡。取PPSP粗多糖，用去離子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分別上樣10ml,待吸附30min后，用相同體積的去離子水分別洗脫,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^(guān)硫酸法檢測,記錄并作洗脫曲線(xiàn)。
洗脫液pH的選擇：選用上述吸附效果較好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分別溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS緩沖液中，經(jīng)0.45^m濾膜過(guò)濾，緩慢上樣，吸附30min后，用200ml對應pH緩沖液洗脫，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法檢測，記錄并作洗脫曲線(xiàn)。
洗脫方式的選擇：確定交換柱與pH緩沖體系之后，探究不同洗脫方式對PPSP洗脫效果的`影響。取5mg/ml多糖溶液10ml,濾膜過(guò)濾,緩慢上樣，吸附30min。先后分別用蒸餾水、0.05mol/LpH7.6的PBS緩沖液結合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脫。流速1.0ml/min,每管10ml,分別收集。苯酚~硫酸法測定,作洗脫曲線(xiàn)，合并主要峰，透析除鹽，濃縮，冷凍烘干待用。
1.2.4多糖收集和檢測利用美國GE公司蛋白純化儀自動(dòng)收集器收集離子交換層析的洗脫液,采用苯酚4硫酸法跟蹤檢測各PPSP多糖組分（od490),以管號為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線(xiàn)，收集同種多糖組分。雙蒸水透析48h,每12h換一次水,磁力攪拌。透析完畢,冷凍干燥得各多糖組分。
1.2.5凝膠過(guò)濾層析將處理好的SephcrylS400裝柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分離得到的樣品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，濾膜過(guò)濾后取5ml緩慢上樣，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脫，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法檢測,作洗脫曲線(xiàn)圖。
1.2.6薄層層析樣品處理:取紫心甘薯多糖樣品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸鋇中和，離心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等標準單糖做同樣處理。待硅膠板活化后，用毛細管進(jìn)行點(diǎn)樣。展層劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;顯色劑:苯胺4卩苯二甲酸。
1.2.7紅外光譜鑒定取約1mg已純化的PPSP多糖組分樣品，與適量KBr粉末在白熾燈下干燥磨混均勻，壓片機壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000cm-1~400cm-1區間掃描。
1.2.8MTT法檢測PPSP多糖組分對Hela和HepG2腫瘤細胞的體外抑制作用參見(jiàn)文獻。取對數生長(cháng)期的Hela和HepG細胞，分別用胰蛋白酶消化后接種于96孔板中。設置不同PPSP多糖組分濃度的實(shí)驗組，將標準葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三種多糖組分臨用前用PBS配置成終濃度為10、20、40、80^g/ml溶液,紫外滅菌。每個(gè)實(shí)驗組的各濃度梯度組,每孔加上述多糖組分溶液20空白對照組加入相同體積的PBS,每組設4個(gè)復孔，置于37C,5%CO2培養箱培養。在加樣后第24、8、96h時(shí)各取一塊96孔板，加入20^lMTT溶液繼續培養4h。小心吸盡培養液，加入200^lDMSO,震蕩,使藍紫色結晶物充分溶解,于490nm波長(cháng)下測各孔吸光度。腫瘤細胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A實(shí)驗組/A空白對照組）x100%。
1.3數據處理采用SPSS18.0進(jìn)行數據處理和分析,實(shí)驗數據取三次平均值,采用方差分析（F檢驗）,有顯著(zhù)差異時(shí)，再作共同對照t檢驗，以P<0.05為差異有統計學(xué)意義。
2結果與分析
2.1多糖提取及標準曲線(xiàn)經(jīng)堿提法獲得紫心甘薯粗多糖,經(jīng)計算其得率為31.72%;檢測到樣品中糖含量為55.4pg/ml,糖醛酸含量為
11.51^g/ml；實(shí)驗得出葡萄糖標準曲線(xiàn)為：A=0.5C-0.005(R=0.9986),糖醛酸標準曲線(xiàn)為：A=0.0053C(R2=0.9991)。
2.2離子交換層析
不同類(lèi)型弱離子交換柱選擇在一定條件下，分別經(jīng)DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱和CM-Cellulose弱陽(yáng)離子柱父換洗脫，洗脫圖見(jiàn)圖1。圖1(a)的洗脫峰基本對稱(chēng),峰形較規則;相比之下，圖1(b)的洗脫峰較寬，無(wú)對稱(chēng)性且分布不均勻。推測DEAE-Cellulose柱對PPSP多糖的選擇吸附性要比CM-Cellulose柱好，因此本實(shí)驗選用DEAE-Cellulose柱分離PPSP多糖。2.2不同pH緩沖液選擇PPSP多糖經(jīng)不同pH值的PBS緩沖液洗脫得洗脫圖，見(jiàn)圖2。多糖是一類(lèi)多羥基聚合物，中性或酸性多糖容易在堿性條件下被弱陰離子交換柱吸附。從圖
2(a)分析可知,pH7.2的緩沖液洗脫時(shí)并沒(méi)有出現對稱(chēng)峰形,繼續洗脫得到拖尾峰。圖2(b)顯示,pH7.6的緩沖液在洗脫體積為100ml時(shí)開(kāi)始出峰,且峰形對稱(chēng)、均一、含量較大。結合圖2(c)和圖2(d)分析,洗脫液堿性條件(pH大于8.2)對PPSP多糖分離不利，因此PPSP多糖分離的最佳洗脫緩沖液pH值為7.6。
2.2.3洗脫方式優(yōu)化在pH7.6的條件下,將PBS緩沖液結合NaCl溶液進(jìn)行0~1mol/ml濃度范圍的線(xiàn)性洗脫（圖3)�？梢钥闯�，第一個(gè)PPSP多糖組分分離完全,但繼續洗脫后并沒(méi)有將剩余多糖組分很好地分離。推測線(xiàn)性洗脫時(shí)低鹽濃度對PPSP的分離有效，高濃度鹽溶液不適用于該多糖的分離。
與線(xiàn)性梯度洗脫相比較，分段洗脫更適用于不同多糖組分間的分離，峰形陡而尖且相對
完整,見(jiàn)圖3。收集四個(gè)多糖組分吸收峰，分別命名為ppspI、ppspn、ppspm和ppspw。前三個(gè)多糖組分的含量相對較高，經(jīng)過(guò)SephcrylS-400凝膠柱后得到了單一對稱(chēng)峰,純度較好。
根據以上實(shí)驗結果，本實(shí)驗選用以下條件來(lái)進(jìn)行PPSP多糖的離子交換色譜分離：弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose；在pH7.6的0.05mol/LPBS緩沖液（I(2HPO44CH2PO4)體系下,采用200mlPBS緩沖液、200ml0.1mol/LNaCl溶液、300ml0.3mol/LNaCl溶液和100ml0.5mol/LNaCl溶液進(jìn)行分段洗脫。
1.3薄層層析結果完全酸水解的紫心甘薯多糖PPSPI、PPSPH、PPSP1,二次層析結果分析多糖組分的單糖組成為:PPSPI主要由葡萄糖和半乳糖組成，ppspn主要由葡萄糖組成;ppspm沒(méi)有檢測到結果，分析可能與其糖蛋白成分干擾有關(guān)。
2.4紅外光譜結構分析ppsph的紅外光譜圖（圖4):881cm-1的峰表明PPSPH中的糖苷鍵為P型（a型糖苷鍵的吸收峰在890cm-1左
右處）。1097cm-1和1041cm-1的吸收峰表在1384~1076cm-1具有明顯特征吸收峰），示PPSPH中的糖環(huán)構型為吡喃型（呋喃型糖環(huán)表明PPSPH具有P~D-葡萄吡喃聚糖的特征吸收峰。
PPSP1的紅外光譜圖（圖5)：在3422cm-1附近有O-H伸縮振動(dòng)的強吸收峰，1630cm-1可能是~CHO中C=O的伸縮振動(dòng),這兩組峰是多糖的特征吸收峰;1100cm-1可能是C4的彎曲振動(dòng)峰,另外,在1425cm-1具有較弱的吸收峰，為蛋白質(zhì)特征吸收峰。因此，推測ppspm可能為糖蛋白。
1.5多糖組分對腫瘤細胞株Hela和HepG:的體外抑制作用PPSPn組分對Hela和HepG2腫瘤細胞株的體外抑制效果如圖6所示,PPSPH對Hela和HepG:細胞在體外具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴(lài)效應。從圖6(a)中可看出，10ag/ml劑量組在48h時(shí)達到最大,然后
開(kāi)始下降,20ag/ml和40ag/ml劑量組在24h時(shí)達到最大,80ag/ml劑量組受到強烈抑制,細胞數量一直下降。從圖6(b)圖中可以看出,PPSPn組分
41.83%,61.45%,68.67%(P<0.01)。圖6(c)中顯示，不同濃度的ppspn組分作用下,20ag/ml,40ag/ml,80ag/ml劑量組均在48h時(shí)細胞活力達到最大，然后開(kāi)始下降。從圖6(d)中可看出，PPSPH組分對HepG2細胞株在96h時(shí)均有較高的抑制率,分別為30.76%,36.83%,42.46%,48.53%(P<0.01)。
PPSP1組分對Hela和HepG2腫瘤細胞株的體外抑制效果如圖7所示,PPSP1對Hela和HepG2細胞在體外具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴(lài)效應。從圖7(a)中可看出,20ag/ml和40ag/ml劑
量組在48h時(shí)細胞活力達到最大,80ag/ml劑量組在24h時(shí)細胞活力達到最大,然后開(kāi)始下降。從圖7(b)中可以看出,40ag/ml劑量組在48h和96h的抑制率分別為34.50%和42.07%(P<0.05),80ag/ml劑量組在48h和96h時(shí)的抑制率分別為42.81%(P<0.05)和54.13%(P<0.01)。從圖7(c)中顯示，20ag/ml'40ag/ml'80ag/ml劑量組均在48h時(shí)細胞活力達到最大,然后開(kāi)始下降。從圖7(d)中可得,40ag/ml劑量組在96h時(shí)抑制率為54.68%(P<0.05),80ag/ml劑量組在24h、48h和96h時(shí)抑制率分別為33.15%(P<0.05),41.86%(P<0.05)和71.08%(P<0.01)。
同時(shí),本實(shí)驗在設計了PBS溶液作為空白對照組以外，還選取標準葡萄糖溶液作為實(shí)驗參考。實(shí)驗發(fā)現:加入標準葡萄糖溶液后，Hela和HepGi腫瘤細胞的生長(cháng)趨勢與空白對照組相似,且相應同濃度的標準葡萄糖對兩種腫瘤細胞的抑制不明顯，不存在劑量依賴(lài)效應。
3討論
本實(shí)驗以浙江省臨安市太陽(yáng)鎮紫心甘薯“渝紫263”為研究對象,低溫堿提法獲得紫心甘薯多糖，在比較了ppsp多糖的弱陽(yáng)離子和弱陰離子交換柱的洗脫分離效果后，選用DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱進(jìn)行分離，獲得了4個(gè)多糖組分（PPSPI、PPSPn、PPSPM和PPSP^)。據國外研究報道13,中性多糖和酸性多糖常通過(guò)弱陰離子交換柱進(jìn)行分離,低鹽濃度下洗脫得到中性多糖，而高鹽濃度下洗脫的多為酸性多糖；中性多糖可以進(jìn)一步經(jīng)凝膠過(guò)濾層析被分離成a-葡聚糖（吸附較強）和p肩聚糖（吸附較弱）。本實(shí)驗中發(fā)現,ppspI在低鹽濃度下最先被洗脫出來(lái)，且經(jīng)檢測不含糖醛酸,推測PPSPI為中性多糖組分,PPSPH、PPSPM和PPSPW隨后被洗脫分離，推測為酸性多糖。紫心甘薯多糖組分的體外抑癌實(shí)驗結果表明，酸性多糖PPSPH和PPSPM在體外對Hela和HepGi腫瘤細胞株生長(cháng)有一定的抑制作用，而中性多糖PPSPI無(wú)明顯的抑制效果。以上結果與文獻報道的天然活性多糖中酸性多糖對癌細胞生長(cháng)有較明顯抑制效果的觀(guān)點(diǎn)相符M。
多糖組分的結構與其生物活性之間的關(guān)系一直是研宄的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。天然活性多糖中含有豐富的中性多糖和酸性多糖，單糖間以糖苷鍵相連,有些單糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)相連,構成糖蛋白或糖脂，這些不同的連接方式賦予了天然活性多糖抗腫瘤活性的良好結構基礎&443。本實(shí)驗從PPSP多糖對腫瘤細胞體外抑制實(shí)驗結果中初步表明“渝紫263”中所含的天然活性多糖中的PPSPH和PPSPM組分具有一定的體外抑癌活性，分析可能與它所含有的P~D-葡萄吡喃聚糖和糖蛋白成分有關(guān)。目前PPSPH、PPSPM組分的構效分析仍在深入研究中。
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