熒光素酶基因原理報告

熒光素酶基因原理報告

　　Luciferase報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測螢

　　火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì )發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過(guò)熒光測定儀也稱(chēng)化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉錄因子與目的基因啟動(dòng)子區DNA相互作用的一種檢測方法。

　　雙熒光素酶報告基因測試∶ 結合螢火蟲(chóng)和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報告基 測試技術(shù)在用螢火蟲(chóng)熒光素酶定量基因表達時(shí), 通常采用第二個(gè)報告基因來(lái)減少實(shí)驗的變化因素。但傳統的共報告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不夠便利,因為各自的測試化學(xué),處理要求檢測特點(diǎn)存在差異。

　　Promega提供一種先進(jìn)的雙報告基因技術(shù),結合了螢火蟲(chóng)熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL 載體系統,表達第二個(gè)報告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報告基因測試,快速,靈敏,簡(jiǎn)便。系統還提供 PLB裂解液,用來(lái)裂解在多孔板中培養的哺乳細胞,不需操作單個(gè)樣品。對于正在使用螢火蟲(chóng)熒光素酶報告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報告基因測試系統將使他們體會(huì )到該系統的便利。

　　應用原理

　　轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，也稱(chēng)為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合，這些特異性的序列被稱(chēng)為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實(shí)現共價(jià)結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實(shí)驗（luciferaseAssay）是檢測這類(lèi)轉錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合的重要手段。

　　其原理簡(jiǎn)述如下：

　�。�1）構建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

　�。�2） 將要檢測的轉錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉染293細胞或其它相關(guān)的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì )表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

　�。�3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光素，通過(guò)檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。

　　工作流程

　�。�1） 用生物信息學(xué)方法分析并預測啟動(dòng)子區可能的轉錄因子結合位點(diǎn)。

　�。�2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

　�。�3）篩選陽(yáng)性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。

　�。�4） 擴增轉錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準備相應的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

　�。�5） 培養293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長(cháng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。

　�。�6） 將報告基因質(zhì)粒與轉錄因子表達質(zhì)粒共轉染細胞。

　�。�7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

　�。�8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

　�。�9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。

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