實(shí)驗一、槐米中蘆丁的提取、精制和鑒定

　�。ㄒ唬�實(shí)驗目的要求

　　制備蘆丁，供藥用。

　　通過(guò)蘆丁的制備，掌握黃酮類(lèi)化合物的提取分離的原理和操作。

　　熟悉重結晶技巧。

　　了解和掌握黃酮類(lèi)化合物的一些主要性質(zhì)和鑒定方法。

　�。ǘ�）實(shí)驗的基本原理

　　1、蘆丁的提取原理

　　利用蘆丁結構中含有多個(gè)酚羥基，呈酚酸性，能在堿水中溶解的性質(zhì)，可用堿性溶劑進(jìn)行提取，提取液加酸后可沉淀析出（堿溶酸沉法）。也可利用蘆丁在冷水中溶解度小，在熱水中溶解度大的性質(zhì)進(jìn)行提取。

　　2、蘆丁的分離原理

　　利用蘆丁結構在冷乙醇中溶解度小，在熱乙醇中溶解度大，以及在熱水中溶解度大，在冷水中溶解度小的性質(zhì)分離。蘆丁用溶劑加熱溶解后，趁熱抽濾，濾液放冷后能析出而達到分離的目的（如不純可再重復操作進(jìn)行分離）。也可采用醇溶水沉法進(jìn)行精制。

　　3、蘆丁的鑒定原理

　�。�1）利用吸附薄層色譜的分離原理，蘆丁與蘆丁對照品在同一條件下進(jìn)行展開(kāi)，顯色，以達到鑒定蘆丁的目的。

　�。�2）通過(guò)專(zhuān)屬的化學(xué)顯色反應（如三氯化鋁顯色反應），確定蘆丁的成分類(lèi)型（黃酮類(lèi)）。

　�。ㄈ�）實(shí)驗內容

　　1、用堿提法、水提法、醇提法提取槐米中蘆丁。

　　2、用酸沉法和冷卻過(guò)飽和法分離蘆丁。

　　3、溶劑重結晶精制蘆丁。

　　4、薄層色譜法和顯色反應鑒定蘆丁

　�。ㄋ模�實(shí)驗藥材儀器與試劑

　　1、實(shí)驗藥材：槐米20g。

　　2、儀器：磁力加熱攪拌器、旋轉蒸發(fā)儀、粉碎機、500ml燒杯，1000ml燒杯，50ml燒杯，250ml園底燒瓶、500ml園底燒瓶、100ml量筒、50ml量筒、100ml錐形瓶、50ml錐形瓶、研缽、移液管、減壓過(guò)濾裝置，布氏漏斗，抽濾瓶、層析缸等。

　　3、試劑：硼砂、氧化鈣、 HCI、三氯化鋁、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸、濾紙、PH試紙等。

　�。ㄎ澹�實(shí)驗方法與注意事項

　　1、蘆丁的提取

　�。�2）方法二（水提取法）稱(chēng)取槐米粗粉20g，在研缽中研碎后放入500ml燒瓶中，（注意小心沿側邊放入磁子），加水200ml，用磁力加熱攪拌器加熱煮沸30min，（設定溫度為105°C，當加熱到103°時(shí)，觀(guān)察到：液體開(kāi)始沸騰，有氣味，有泡沫產(chǎn)生。藥材翻滾，圓底燒瓶壁有水滴。且隨著(zhù)時(shí)間的增多，泡沫越來(lái)越多，加熱20min左右后，泡沫豐富。稍調低轉速。），趁熱過(guò)濾。殘渣同法操作一次，合并兩次濾液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，（觀(guān)察到：析出后，有黃色晶體，上清液為棕色，香卞甘味。抽濾時(shí)，固體為淡黃色。烘干后，呈黃綠色）。減壓抽濾，用少量蒸餾水洗滌蘆丁結晶，抽干，得粗制蘆丁，干燥，稱(chēng)重，計算得率。（濾紙+漏斗145、02g，濾紙+漏斗+樣品146、617g，故知樣品為1、597g，得率為7、99%）

　�。ǜ郊硬襟E：旋轉蒸發(fā)，濃縮至50ml，觀(guān)察是否有殘余蘆丁。其中，重點(diǎn)注意旋轉蒸發(fā)儀的使用。組裝好儀器后，關(guān)閉玻璃氣閥，打開(kāi)真空泵，至0、05Mpa時(shí)，打開(kāi)加熱開(kāi)關(guān)，旋轉開(kāi)關(guān)等。然后開(kāi)始旋轉蒸發(fā)，過(guò)程中，要耐心等待，并時(shí)刻注意蒸發(fā)液體，防止噴濺出蒸發(fā)瓶，造成實(shí)驗失敗。）

　　2、蘆丁的精制

　�。�1）方法一（醇—水重結晶法）取粗制蘆丁1g，（實(shí)際上為1.008g，其中，粗制蘆丁為淡黃色固體，有香味），置于250ml園底燒瓶中，加90%（實(shí)際為80%）乙醇30ml加熱回流15分鐘，趁熱抽濾。（濾液為黃色透明油狀液體）。濾液置250ml燒杯中，向濾液中加蒸餾水（約3~4倍量）至溶液呈明顯混濁，室溫放置，抽濾得精致蘆丁。用少量蒸餾水洗滌蘆丁結晶，晾干，稱(chēng)重。（濾紙+漏斗29.69g，濾紙+漏斗+樣品30.20g，故知樣品為0.51g）。

　　3、鑒定

　�。�1）點(diǎn)滴顯色反應取蘆丁的甲醇溶液（供試液）分別點(diǎn)在濾紙上，揮去溶劑，然后分別加下列試劑，觀(guān)察顯色前后顏色及熒光的變化。

　　供試液：蘆丁的甲醇溶液。

　　顯色劑：2%三氯化鋁乙醇溶液[在紫外燈下λ365nm觀(guān)察顯色前后顏色及熒光的變化]

　�。�2）薄層色譜鑒定

　　吸附劑：硅膠GF254薄層板（5.0cm X 10.0cm）。

　　樣品：自制蘆�。ㄓ眉状既芙�，濃度約1mg/ml）

　　對照品：蘆丁對照品的甲醇溶液。

　　展開(kāi)劑：三氯甲烷—甲醇—甲酸（7∶3∶0.5）

　　顯色：a、先在可見(jiàn)光下觀(guān)察，然后在紫外光下觀(guān)察（365nm紫外燈下觀(guān)察）

　�。ㄓ^(guān)察到兩點(diǎn)，呈深色）

　　b、噴三氯化鋁試劑前后觀(guān)察顏色變化（365nm紫外燈下觀(guān)察）

　�。▽φ战M為淺褐色，實(shí)驗組為黃綠色，有拖尾）

　　實(shí)驗結果記錄：觀(guān)察斑點(diǎn)顏色，記錄圖譜并計算Rf值。

　　Rf樣品=3.00/5、75=0.522

　　總結：

　　1、實(shí)驗應細心，耐心，如旋轉蒸發(fā)時(shí)。

　　2從失敗中總結經(jīng)驗，改進(jìn)實(shí)驗的方法，為以后積累經(jīng)驗。

　　3、實(shí)驗的過(guò)程中，需要團隊合作，從不同的方面來(lái)注意、分析實(shí)驗，得到最好的結果。

　　5 、注意事項

　�。�1）硼砂因能與蘆丁中的鄰二酚羥基結合，起保護鄰二酚羥基，不被氧化破壞的作用。實(shí)驗證明，提取時(shí)加入硼砂，產(chǎn)品的質(zhì)量會(huì )好些。

　�。�2）石灰乳既能達到堿溶解提取蘆丁的目的，還可以除去槐米中大量的粘液質(zhì)和酸性樹(shù)脂（形成鈣鹽沉淀），但PH不能過(guò)高和長(cháng)時(shí)間煮沸，因為會(huì )導致蘆丁的水解而開(kāi)環(huán)和形成鈣鰲合物，影響產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)率。

　�。�3） PH過(guò)低（酸性太強）會(huì )使蘆丁形成洋鹽而收率降低。

　�。�4）稱(chēng)量蘆丁時(shí)，先將帶濾紙的漏斗稱(chēng)重，再將盛樣品的帶濾紙的漏斗稱(chēng)重，差重即為樣品的重量。

　　實(shí)驗二、牡丹皮中丹皮酚的提取、分離與鑒定

　�。ㄒ唬�實(shí)驗目的要求

　　1、掌握揮發(fā)油的一般提取和鑒定方法。

　　2掌握用水蒸氣蒸餾法從牡丹皮中提取丹皮酚的方法。

　　3掌握丹皮酚的色譜檢識和定性鑒定方法。

　�。ǘ�）實(shí)驗的基本原理

　　利用揮發(fā)油與水不相混合，當受熱后，二者蒸氣壓的總和與大氣壓相等時(shí)，溶液即開(kāi)始沸騰。繼續加熱，則揮發(fā)油可隨水蒸氣蒸餾出來(lái)。丹皮酚具有揮發(fā)性，可隨水蒸氣蒸餾，又因在冷水中難溶，故放冷后析出結晶。

　�。ㄈ�）實(shí)驗內容

　　1、用揮發(fā)油提取器提取牡丹皮中的丹皮酚。

　　2、溶劑重結晶或引種結晶純化丹皮酚。

　　3三氯化鐵顯色反應和薄層色譜法鑒定丹皮酚。

　�。ㄋ模�實(shí)驗藥材儀器與試劑

　　1、實(shí)驗藥材：牡丹皮20g。

　　2、儀器：水蒸氣蒸餾裝置（包括揮發(fā)油提取器、蒸餾瓶500ml、回流冷凝管）、粉碎機、500ml燒杯，量筒，減壓過(guò)濾裝置，濾紙，布氏漏斗，層析缸等。

　　3、試劑：氯化鈉、三氯化鐵、鹽酸、乙醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯等。

　　4材料：GF254硅膠薄層板

　�。ㄎ澹�實(shí)驗方法及注意事項

　　1、丹皮酚的提取

　　取牡丹皮20g（實(shí)際為20.066g），粉碎，置250ml圓底燒瓶（改為“三口瓶”）中，加100ml水、2ml乙醇和8g氯化鈉（實(shí)際為8.043g），（裝儀器時(shí)，注意凡士林的涂抹方法，不是全涂抹于塞子，而是口與塞各涂一半，注意方向），振搖混合后浸潤1h，連接揮發(fā)油提取器并加注冷凝水，自冷凝管上端加水使充滿(mǎn)測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止。（過(guò)程中現象為：乳白色粉末，混合后，顏色變深，上有咖啡色淺浮沫），水浴回流收集蒸餾液（共收集蒸餾液約60ml）。將蒸餾液放冷，分層，開(kāi)啟測定器下端活塞使油層下降至其上端與刻度“0”線(xiàn)平齊，讀取揮發(fā)油量，計算百分含量。（出現問(wèn)題：開(kāi)始加熱時(shí)，油層在下，加熱全部壓回，重新開(kāi)始。后來(lái)，溫度傳感器在瓶中與磁子相吸，處理過(guò)程中，由于頻繁開(kāi)塞且時(shí)間過(guò)長(cháng)，導致大量有效揮發(fā)性油物質(zhì)從側口揮發(fā)，最終未能成功收集到大量油性物質(zhì)。實(shí)驗失�。。┚従彿懦鏊�分，接收揮發(fā)油。揮發(fā)油靜置過(guò)夜，有白色針狀結晶析出，濾取結晶，干燥，稱(chēng)重。如結晶不純，可加入95%乙醇至全部溶解，（約為粗晶的15倍），抽濾，濾液中加入4倍量的蒸餾水，使溶液呈乳白色，靜置后則有大量白色針狀結晶析出。（由于上一步的失敗，未進(jìn)行此步驟，而是與“第七組”共同分享了他們的成果，從而順利進(jìn)行實(shí)驗的下一步。在此表示感謝�。�

　　2、丹皮酚的鑒定

　�。�1）薄層色譜鑒定

　　吸附劑：硅膠GF254薄層板（5.0cm X 10.0cm）。

　　樣品：自制樣品的乙醇液，丹皮酚對照品乙醇溶液

　　展開(kāi)劑：環(huán)己烷—乙酸乙酯—（3：1）或環(huán)己烷—三氯甲烷—無(wú)水乙醇（7：3：1）

　　顯色：噴5%三氯化鐵乙醇溶液或鹽酸酸化的5%三氯化鐵乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰

　　實(shí)驗結果記錄：觀(guān)察斑點(diǎn)顏色，記錄圖譜并計算Rf值。

　　Rf樣品=4、90/7、10=0、690

　　總結：

　　1、本實(shí)驗出現問(wèn)題：溫度傳感器在瓶中與磁子相吸，處理過(guò)程中，由于頻繁開(kāi)塞且時(shí)間過(guò)長(cháng)，導致大量有效揮發(fā)性油物質(zhì)從側口揮發(fā)，最終未能成功收集到大量油性物質(zhì)。實(shí)驗應細心，耐心，不可操之過(guò)急。

　　2 、實(shí)驗的過(guò)程也是探索的過(guò)程，實(shí)驗失敗，得不到產(chǎn)物，需要我們從失敗中總結經(jīng)驗，防止再發(fā)生錯誤；改進(jìn)實(shí)驗的方法，尋找合適的方法。

　　3、實(shí)驗指導及注意事項

　　1、提取完畢后，須待油水完全分層，在接受揮發(fā)油時(shí)，應注意盡量避免帶出水分。

　　2、產(chǎn)品應在干燥、密閉、避光條件下保存（注意，嚴禁放入烘箱中烘干）。

　　實(shí)驗三、黃柏中小檗堿的提取、分離與鑒定

　　實(shí)驗部分

　　實(shí)驗目的要求

　　學(xué)習和掌握小檗堿的結構特點(diǎn)和特殊的理化性質(zhì)，及小檗堿的一般提取精制方法。

　　實(shí)驗的基本原理

　　小檗堿的提取原理

　　根據水溶性季銨堿在乙醇和堿水中溶解度大性質(zhì)，利用乙醇回流法和堿水提取法進(jìn)行提取。

　　小檗堿的分離原理

　�。�1）利用小檗堿的鹽酸鹽在水中溶解度�。�1：500），采用鹽析法使小檗堿沉淀析出，達到純化的目的。

　�。�2）利用鹽析法分離小檗堿

　　實(shí)驗內容

　　1、用乙醇回流提鹽析法、醇索氏提鹽析法和堿滲漉提鹽析法提取黃柏中鹽酸小檗堿。

　　2、溶劑重結晶精制鹽酸小檗堿。

　　3、薄層顯色反應鑒定鹽酸小檗堿

　　實(shí)驗藥材儀器與試劑

　　1、實(shí)驗藥材：黃柏30g。

　　2、儀器：250ml燒瓶、500ml燒杯，冷凝管、滲漉筒250ml，粉碎機、減壓過(guò)濾裝置、紗布、漏斗，層析缸等。

　　3、試劑：氧化鈣，氨水，NaCI，鹽酸、H2SO4，三氯甲烷，甲醇，乙醇，改良碘化鉍鉀等。

　　實(shí)驗方法

　　小檗堿的提取

　�。�2）方法二（醇索氏提鹽析法）稱(chēng)取黃柏30g（實(shí)際上，試驗中取15g），（用粉碎機）粉碎成粗粉，用濾紙包成筒狀，置于索氏提取器中，（由于索氏提取器的內徑較小，在裝入粗粉的過(guò)程中要注意藥粉不能溢出，注意最后藥品不要高于管口），燒瓶中加入210ml的.95%乙醇，（實(shí)驗中由于判斷失誤，開(kāi)始只加了105ml，后來(lái)在過(guò)程中，由于虹吸較難，補加了一部分乙醇，大約70多ml），（水浴提取開(kāi)始時(shí)，未加水浴鍋的蓋，后來(lái)及時(shí)加蓋，并用棉花裹住索氏提取器側管，防止因水蒸氣影響過(guò)熱），（過(guò)程中，觀(guān)察到：提取液剛開(kāi)始為黃色液體，隨著(zhù)提取次數增多，顏色變淡），水浴提取至無(wú)顏色。乙醇提取液濃縮至糖漿狀（濃縮采用旋轉蒸發(fā)儀，現象為：隨著(zhù)蒸發(fā)的進(jìn)行，液體減少，顏色變深），加水約80ml（實(shí)際為40ml），濾出沉淀（樹(shù)脂等雜質(zhì)），濾液加入15%NaCI（W/V）（實(shí)際為6.05g），溶解后（為了加快溶解，可以把加入NaCI的濾液放在水浴上方，并用玻璃棒攪拌），放置過(guò)夜。析出沉淀，（沉淀為黃色固體，溶液為紅棕色），過(guò)濾沉淀物（鹽酸小檗堿）。烘干，稱(chēng)重。（由于電子天平儀器的故障，第一次測量得到負質(zhì)量。除去漏斗，重新采用分析天平測得：樣品+濾紙為0.4603g，濾紙為0.54516g，故粗略得樣品0.0087g。雖產(chǎn)量較低，但也是所有實(shí)驗組中唯一成功的一組，得到了經(jīng)驗：。

　　鹽酸小檗堿的精制

　�。�2）方法二：取上述鹽酸小檗堿粗品全部，放入適宜的小錐形瓶（實(shí)際為燒瓶）中，加25倍量沸水，水浴加熱溶解，趁熱過(guò)濾，濾出不溶物，濾液在65℃時(shí)加濃鹽酸調PH2～3，放置1～2h，析晶，用蒸餾水洗至PH4.8，80℃以下干燥，得精制鹽酸小檗堿，稱(chēng)重，計算得率。（由于粗制得的樣品較少，未進(jìn)行此步驟，直接進(jìn)入鑒定）。

　　鑒定

　�。�1）檢識反應

　　取鹽酸小檗堿（淺黃色）少許，加蒸餾水3ml（10ml），緩緩加熱，（小檗堿逐漸溶解，成淺黃色液體），溶解后加氫氧化鈉試液2滴（10滴），顯橙色，溶液放冷，過(guò)濾，取澄清濾液，加丙酮4滴，即發(fā)生混濁。（加入丙酮后可觀(guān)察到黃色渾濁）放置，生成黃色小檗堿沉淀。

　�。�2）薄層色譜鑒定

　　吸附劑：硅膠GF254薄層板（5.0cm X 10.0cm）。

　　樣品：自制鹽酸小檗堿（用甲醇溶解）

　　展開(kāi)劑：三氯甲烷—甲醇—氨水（14∶4∶0.5）

　　顯色：a、先在可見(jiàn)光下觀(guān)察，（觀(guān)察到點(diǎn)呈黃色，由于產(chǎn)品不純，樣品點(diǎn)后面還有拖尾現象）。然后在紫外光下觀(guān)察。（可以明顯的觀(guān)察到兩點(diǎn)的位置，為明顯的黑藍色，拖尾現象很明顯）。

　　b、噴改良碘化鉍鉀液顯色，前后觀(guān)察顏色變化（由黃色變?yōu)辄S棕色）。

　　實(shí)驗結果記錄：觀(guān)察斑點(diǎn)顏色，記錄圖譜并計算Rf值。

　　Rf樣品=4.10/7.60=0.539

　　Rf對照=3.40/7.60=0.741 （可看出，在純度上與對照品還是存在一定的差距）。

　　總結：

　　1、實(shí)驗應細心，耐心，不可操之過(guò)急。

　　2．從實(shí)驗得率低中，知道了藥物中要提取有用成分含量是很少的，析晶過(guò)程需要的時(shí)間很長(cháng)，故藥物總是如此之貴。

　　3、實(shí)驗的過(guò)程也是探索的過(guò)程，每次實(shí)驗都有可能失敗，得不到產(chǎn)物或者產(chǎn)物量，需要我們從失敗中總結經(jīng)驗，改進(jìn)實(shí)驗的方法，尋找到最合適的方法。

　　4、實(shí)驗的過(guò)程中，需要團隊合作，不同人從不同的方面來(lái)分析實(shí)驗，總結出誤差來(lái)源。

　　實(shí)驗指導及注意事項

　　1、從黃柏中提取小檗堿時(shí)，宜采用石灰浸泡，使所含的大量粘液質(zhì)形成鈣鹽難溶于水而不被提出。

　　2、在精制鹽酸小檗堿的過(guò)程中，加熱煮沸以后，應迅速抽濾，以免溶液在過(guò)濾過(guò)程中變冷而析出鹽酸小檗堿結晶，造成產(chǎn)量損失。

　　3、加熱溶解樣品時(shí)溫度不宜太高，時(shí)間不宜太長(cháng)，否則很容易析出固體，影響晶形。

　　4、小檗堿的干燥溫度不宜太高，否則產(chǎn)品的顏色加深，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。

　　5、展開(kāi)劑中加氨水的量應嚴格控制，所用的容器一定要干，展開(kāi)劑配好后不能產(chǎn)生混濁。

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